إنتاجية عالية في الموقع أسلوب التهجين لتوصيف أنماط التعبير مرنا في الفأر الجنينية السفلى المسالك البولي التناسلي
Summary
هنا ، نحن تصف كفاءة عالية الإنتاجية<em> في الموقع</em> التهجين (ISH) طريقة لتصور أنماط التعبير مرنا في تطوير قطاعات النسيج الجنيني الماوس البروستاتا. ويمكن تكييفها بسهولة طريقة لتصور أنماط التعبير مرنا في الأنسجة الماوس الأخرى أو في أنسجة من الأنواع الأخرى.
Abstract
تطوير الجهاز البولي التناسلي السفلي (طرفية) هي عملية معقدة. ويتجلى هذا التعقيد خلال تشكيل البروستاتا من مجرى البول الجنين الذكر ، والذي يعتمد على إشارات وأندروجيني الظهارية – الوسيطة 1،2 التفاعلات. قد فهم الآليات الجزيئية المسؤولة عن التنمية البروستاتا تكشف آليات النمو التي أيقظ بشكل غير لائق في وقت لاحق في الحياة أن يؤدي إلى نشوء أمراض البروستاتا مثل تضخم البروستاتا الحميد وسرطان البروستاتا.
وLUT النامية معقدة تشريحيا. من البروستاتا الوقت الناشئين يبدأ في تصور آخر 16.5 يوما (DPC) ، العديد من أنواع الخلايا موجودة. الأوعية الدموية والأعصاب والعضلات الملساء الموجودة داخل سدى الوسيطة 3. هذا سدى يحيط ظهارة متعددة الطبقات ويثير البروستاتا الجنين من خلال مستقبلات الاندروجين التي تعتمد على اشارات نظير الصماوي 4. هوية مستقبلات الاندروجين اللحمية التي تستجيب للجينات اللازمة للتنمية البروستاتا والآلية التي لا تشكل البروستاتا ظهارة الأقنية استجابة لهذه الجينات مفهومة تماما. القدرة على التعرف على أنواع الخلايا بدقة التعبير وتوطين من العوامل المحددة في داخلها لا بد من زيادة فهم التنمية البروستاتا. التهجين في الموقع (ISH) يسمح لتوطين mRNAs داخل الأنسجة. وبالتالي ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد نمط وتوقيت التعبير عن جزيئات الإشارات والمستقبلات الخاصة بهم ، وبالتالي توضيح المنظمين المحتملين البروستاتا التنموية.
هنا ، نحن تصف ISH إنتاجية عالية التقنية لتحديد أنماط التعبير مرنا في طرفية الماوس الجنين باستخدام تهتز مشراح قطع المقاطع. هذا الأسلوب يوفر مزايا عديدة أكثر من البروتوكولات ISH الأخرى. أداء ISH على المقاطع رقيقة تنضم إلى شريحة من الصعب من الناحية الفنية ، وكثيرا ما cryosections نوعية الهيكلية الفقراء في حين أن كلا cryosections البارافين والمقاطع غالبا ما تؤدي إلى القرار إشارة ضعيفة. ويمكن أداء ISH على أنسجة جبل بأكمله في محاصرة نتيجة التحقيق. في المقابل ، لدينا إنتاجية عالية التقنية تستخدم قطع سميكة المقاطع التي تكشف بالتفصيل بنية الأنسجة. أنابيب microfuge تعديل تسمح سهولة التعامل من خلال المقاطع الإجراء ISH. ويمكن فحص كحد أقصى المحاضر مرنا 4 من طرفية a 17.5dpc واحد مع ما يصل الى 24 مرنا النصوص المكتشفة في شوط واحد ، وبالتالي تقليل التكاليف وتعظيم الكفاءة. هذا الأسلوب يسمح لمعالجتها معالجة مجموعات متعددة مماثل وكوحدة واحدة ، وبالتالي إزالة أي تحيز لتفسير البيانات. الأكثر تعلقا الباحثين البروستاتا ، وهذا الأسلوب يوفر الموقع المكاني والزماني للالمنخفضة والعالية وفرة النصوص مرنا في مجرى البول الماوس الجنين الذي يولد لشبكة الأقنية البروستاتا.
Protocol
Discussion
باستخدام الطريقة الموصوفة هنا ، فإنه من الممكن الكشف عن mRNAs في جميع أنواع الخلايا الرئيسية ومقصورات أنسجة الجنين الماوس طرفيات المستعملين المحليين من الذكور والإناث بما في ذلك منصات الوسيطة ، الظهارة البولية ، العضلات الملساء ، براعم البروستاتا ، لاصق قذفي والمهبل….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور لان يي ، معهد السرطان في نيو جيرسي ، للحصول على المساعدة الفنية في إعداد سلات الأنسجة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة DK083425 المنح وDK070219.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Applied Science | 11214667001 |
| Blocking reagent | Roche Applied Science | 11096176001 |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Applied Science | 11442074001 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Applied Science | 1277073910 |
| dNTPs | Roche Applied Science | 11969064001 |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 |
| Formamide | Sigma | F5786-1L |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma | G6257-100ML |
| Heparin, sodium salt | Sigma | H3393 |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 |
| Levamisole | Sigma | L9756 |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp. | 46551 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 |
| Maleic acid | Sigma | M0375-500G |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 |
| Polyester mesh, 33 micron, 12” x 24” | Small Parts Inc | CMY-0033-D |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase |
| RNase | Sigma | R6513 |
| RNase inhibitor | Roche Applied Science | 03335399001 |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega | M6101 |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza | 50101 |
| Sheep serum | Sigma | S2263-500mL |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | Millipore | SCGPU05RE |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 |
| SSC, 20X solution | Research Products International | S24022-4000.0 |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 |
| T7 RNA polymerase | Roche Applied Science | 10881767001 |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A |
| Yeast tRNA | Roche Applied Science | 109495 |
References
- Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions–I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
- Rozen, S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).
- Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).
- Vezina, C. M. Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate. Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).
- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
