Summary
We beschrijven hier een efficiënte high throughput
Abstract
De ontwikkeling van het lagere urogenitale tractus (LUT) is een ingewikkeld proces. Deze complexiteit blijkt tijdens de vorming van de prostaat van de foetus mannelijk urethra, die zich baseert op androgene signalen en epitheliale-mesenchymale interacties 1,2. Inzicht in de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de prostaat ontwikkeling kan uitwijzen groei mechanismen die ten onrechte zijn later in hun leven opnieuw tot leven gewekt om aanleiding te geven tot prostaat ziekten zoals benigne prostaathyperplasie en prostaatkanker.
De ontwikkelingslanden LUT is anatomisch complex. Tegen de tijd dat de prostaat ontluikende begint op 16,5 dagen na de conceptie (DPC), een groot aantal celtypen aanwezig zijn. Vaatstelsel, de zenuwen en het gladde spierweefsel verblijven binnen de mesenchymale stroma 3. Dit stroma omringt een meerlagig epitheel en geeft aanleiding tot de foetale prostaat via androgeenreceptor-afhankelijk paracriene signalen 4. De identiteit van de stromale androgeenreceptor-responsieve genen die nodig zijn voor de prostaat ontwikkeling en het mechanisme waarmee de prostaat ductaal epitheel vormen in reactie op deze genen niet volledig begrepen. De mogelijkheid om nauwkeurig te identificeren en te lokaliseren soorten cellen de expressie van specifieke factoren in hen is noodzakelijk om verder te begrijpen prostaat ontwikkeling. In situ hybridisatie (ISH) zorgt voor lokalisatie van mRNA's in een tissue. Zo kan deze methode worden gebruikt voor het patroon en de timing van expressie van signaalmoleculen en hun receptoren te identificeren, waardoor het ophelderen van de potentiële prostaat ontwikkeling toezichthouders.
We beschrijven hier een hoge doorvoersnelheid ISH techniek om mRNA expressie patronen te identificeren in de foetale muis LUT met behulp van trillende microtoom gesneden secties. Deze methode biedt een aantal voordelen ten opzichte van andere ISH protocollen. Het uitvoeren van ISH op dunne secties gehandeld op grond van een dia is technisch moeilijk, vriescoupes hebben vaak een slechte structurele kwaliteit, terwijl zowel de vriescoupes en paraffinecoupes resulteren vaak in een zwak signaal resolutie. Het uitvoeren van ISH op hele berg weefsel kan resulteren in een probe vangen. In tegenstelling tot onze high throughput techniek maakt gebruik van dik gesneden secties die gedetailleerde weefsel architectuur zichtbaar te maken. Gewijzigd microfugebuizen buizen een gemakkelijke bediening mogelijk van onderdelen tijdens de ISH procedure. Er kunnen maximaal 4 mRNA transcripten kan worden afgeschermd van een enkele 17.5dpc LUT met maximaal 24 mRNA transcripten gedetecteerd in een enkele run, waardoor de kosten en het maximaliseren van efficiency. Met deze methode kunnen meerdere behandelingsgroepen tot identiek en als een geheel worden verwerkt, zodat er geen voorkeur voor het interpreteren van data. De meeste pertinent voor prostaatkanker onderzoekers, deze methode zorgt voor een ruimtelijke en temporele locatie van de lage en hoge overvloed mRNA transcripten in de foetale muis urinebuis die aanleiding geeft tot de prostaat ductaal netwerk.
Protocol
1. Synthese van een digoxigenine-11-UTP-gemerkte Riboprobe van een PCR gegenereerde Template
- Te synthetiseren een gen-specifieke riboprobe, gebruik Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) om het gen cDNA referentie sequentie (RefSeq) te verkrijgen. Gebruik de Primer3 programma (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 tot gen-specifieke PCR-primers ontwerp ten opzichte van de 3'-gebied van de cDNA-sequentie. Aanbevolen parameters voor PCR-primer selectie zijn elders beschreven (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html).
- Gebruik de Megablast Program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090) 6 tot specificiteit van de geselecteerde DNA-sequentie te beoordelen. De DNA-sequentie is specifiek overwogen wanneer, met behulp van een VERWACHTEN drempel van 0,01, is het niet op een lijn met andere sequenties in de RefSeq database.
- PCR versterken het riboprobe sjabloon. PCR-reactie componenten en thermocycling voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd voor elke primer in te stellen. Een typische 50 ul reactie bevat: 1X buffer, 2mm MgCl 2, 0,2 mm dNTPs, 1X Q oplossing, 1μg cDNA, 2.5U Taq DNA-polymerase, 0.25μm primers, en nuclease vrij van H 2 O. Een typisch thermocycling protocol bevat een eerste denaturatie bij 94 ° C voor 2 minuten gevolgd door 40 cycli van 94 ° C gedurende 30 sec, 57 ° C voor 30 sec, 72 ° C gedurende 1 minuut en een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10min. De cDNA gebruikt in de PCR-reacties wordt gesynthetiseerd uit de muis urogenitale mRNA.
- Scheid de PCR-product door agarosegelelektroforese, zuiveren met behulp van de Gel Extraction Kit, en kwantificeren van de gezuiverde producten door spectrofotometrie. De verwachte opbrengst is 1,2 - 3.6μg.
- Transcriberen het PCR-product in een gelabelde riboprobe. De transcriptie reactie (40 pl) bevat: 400ng gezuiverde PCR product, 1X nucleotide etikettering mix met digoxigenine 11-UTP, 1X transcriptie buffer, 5U RNase-remmer, 80U T7 RNA-polymerase, en nuclease-vrij H 2 O. Incubeer 3-4HR bij 37 ° C en schud samples elke 30min.
- Gebruik maken van de Qiagen RNeasy Mini kit om riboprobes op basis van instructies voor het RNA-schoonmaak met on-column DNase spijsvertering te zuiveren. Kwantificeren riboprobes door spectrofotometrie. De verwachte opbrengst is 40 tot 20 microgram. Beoordeel probe kwaliteit door het scheiden van een aliquot door elektroforese op een 1,5% niet-denaturerende agarose gel. Hoge kwaliteit sondes migreren als afzonderlijke banden met minimale vegen.
- Om ervoor te zorgen de riboprobe specifiek zijn doel herkent, ook een positieve controle weefsel voor de eerste ISH experiment. De riboprobe De doel-mRNA patroon moet bekend zijn in deze positieve controle weefsel.
2. Voorbereiding van de Vibrating Microtoom Blade (Gebaseerd op eerder beschreven Protocol) 7
- Bereid een 4% laag-melt agarose oplossing in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Microwave oplossing voor agarose op te lossen en te onderhouden oplossing bij 62 ° C.
- Bereid een polystyreen ring vorm door het verwijderen van het membraan van een 12mm diameter Millicell cultuur plaat goed te voegen en te behouden polystyreen ring te gebruiken als een agarose mal. Geniet van de ringen overnachting in RNase-remmer oplossing voor elk gebruik.
- Om ervoor te zorgen een glad snijvlak, roest-remmer en andere additieven van het oppervlak van de Wilkinson mes door spoelen met de volgende oplosmiddelen, bij 100% concentratie: petroleumether, xyleen, chloroform, methanol, en MilliQ water. Lengte scheiden de dubbel lemmet in twee afzonderlijke bladen.
- Houden de Wilkinson mesjes om een microtoom blad met Loctite lijm. De microtoom blad wordt niet gebruikt voor het snijden; het voegt stijfheid van de Wilkinson blad. De microtoom mes moet worden teruggebracht tot de lengte van het Wilkinson mes met behulp van metalen scharen en, eenmaal gehandeld, moet worden gecompenseerd door een 3 - 4 mm van het snijvlak van het mes Wilkinson.
3. Dissection, opslag, en de voorbereiding van Urogenitale weefsels voor het snijden
- Bereid PBSTw oplossing (PBS met 0,1% Tween ™ 20 en 0,2 mm natriumazide, gefilterd door de 0.22μm Stericup ® filter). Oplossing kan worden voorbereid en opgeslagen bij 25 ° C.
- Incubeer een vers ontleed muis LUT (blaas, bekken urethra, en de bijbehorende Wolffian en Mϋllerian duct-afgeleide structuren) overnacht bij 4 ° C in PBS met 4% paraformaldehyde fixeermiddel.
- Uitdrogen weefsels door het wassen voor 10min bij 25 ° C in een reeks van gegradeerde methanol / PBSTw (1:3, 1:1, 3:1 v / v) oplossingen. Bewaar monsters bij -20 ° C, in 100% methanol in ieder geval 's nachts. Gearchiveerd weefsels kunnen worden bewaard op zijn minst 2yr.
- Bereid weefsels voor het snijden door hydrateren gearchiveerd weefsels. Was voor 10min bij 25 ° C in een reeks van gegradeerde methanol / PBSTw (3:1, 1:1, 1:3 v / v) oplossingen.
- Ontleden en gooi ongeveer tweederde van de blaas, waardoor het grootste deel van het trigonum regio aan de plasbuis.
- Naar beneden plaats de polystyreen ring schimmel, vlakke ondergrond, op een 25 ° C gewoon glas microscoopglaasje.
- Vul de ring mal met 62 ° C agarose-oplossing en koel voor ongeveer 2min.
- Verwijder de LUT weefsel van PBSTw en dep droog op een absorberend doekje.
- Breng de weefsel in agarose oplossing.
- Een tang om oriënteren de LUT weefsel in agarose, zodat het halverwege is opgehangen tussen de boven-en onderkant van de ring schimmel en incubeer het weefsel bij 4 ° C tot de agarose is gestold.
- Als het weefsel volledig zinkt tijdens het proces van agarose stolling, kan het worden uitgesneden uit de agarose-en re-ingebed. Pas de koeltijd van de agarose als nodig tijdens de re-embedding proces.
5. Snijden Urogenitale weefsel met een Vibrating Microtoom (Gebaseerd op eerder beschreven Protocol) 7
- Monteer de versterkte Wilkinson mes in de trillende microtoom en zet het mes hoek van 35 °. Vul luxe exemplaar bad met PBS en pak nat ijs rond het monster bad.
- Verwijder de gestolde agarose stekker uit de ring vorm en dep de onderkant met een absorberend doekje. Controleer of het weefsel in de juiste richting. Weefsels oriëntatie kan worden aangepast met behulp van een scheermesje af te schuinen de vlakke rand van de agarose stekker.
- Houden de agarose stekker op een vibrerende microtoom exemplaar montageschijf met Loctite lijm zoals getoond in Fig. 1A.
- Plaats het monster montageschijf in de vibratome.
- Stel de microtoom gedeelte dikte 50μm, de snelheid naar 2, en het mes amplitude tot 4 en gaan knippen weefselcoupes.
- Gebruik stompe tang om elk weefsel sectie (Fig. 1B) over te dragen aan een 24-well plaat cultuur goed, dat ijskoude 0,5 ml PBSTw bevat.
- Voor te bereiden monsters voor in situ hybridisatie, accijnzen grootste deel van de agarose rond elk weefsel gedeelte (de resterende agarose zal smelten tijdens de ISH procedure) en verwijder alle bijbehorende vuil. Store secties tot 48hr bij 4 ° C in PBSTw.
6. Besteloverzicht Voorbereiding voor in situ hybridisatie
- Snijd de bodem van een microcentrifugebuis op de 100μL markeren.
- Verwarm de afgesneden rand van de buis in een vlam tot het plastic wordt zacht, druk dan op de microcentrifugebuis stevig op het midden van een 0.5in polyester mesh plein.
- Knip overtollige gaas en gebruik een verwarmde 18 gauge naald te prikken twee gaten in elke buis deksel aan winkelmandje voorbereiding (Fig. 1C) te voltooien.
- Verwijder het deksel van een 24 wells plaat en boor een gat 12 mm gecentreerd op elk putje. Gebruik het deksel te proeven manden tussen wasbeurten van de ISH-protocol (fig. 1D) over te dragen.
7. Embryo poeder Voorbereiding voor in situ hybridisatie (Gebaseerd op eerder beschreven Protocol) 8
- Verzamel muis embryo weefsel van muizen die dezelfde fase als het weefsel secties die worden beoordeeld en op te slaan bij -80 ° C. Plaats bevroren weefsel in een keramisch vijzel, onderdompelen weefsel in vloeibare stikstof, en gebruik een stamper om weefsel te vermalen tot een fijn poeder.
- Combineer embryo poeder met vier volumes van aceton en gehomogeniseerd met een aantal slagen van een dounce homogenisator.
- Overdracht homogenaat om een 15 ml glazen flacon schroef-top en extract overnacht bij 4 ° C.
- Pellet embryo poeder door centrifugeren bij 5000rpm voor 10min bij 4 ° C. Verwijder de lipide-bevattende supernatant. Resuspendeer het weefsel pellet in 4vol van verse aceton en extraheer gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Pellet het embryo poeder door centrifugeren bij 5000rpm voor 10min bij 4 ° C. Verwijder de supernatant.
- De lucht drogen de pellet op een # 2 Whatman filter papier. Crush pellet tot een fijn poeder en bewaar in een goed afgesloten glazen flesje opbrengst bij 4 ° C. De geschatte opbrengst is 50 mg poeder per 1 g embryo nat gewicht.
8. In situ hybridisatie Dag 1
- Verwarm prehybridisatie-oplossing (50% formamide, 5x SSC, 1% blokkeren reagens, 10μg/mL gist tRNA, 10μg/mL heparine op te slaan bij -20 ° C) tot 60,5 ° C. Deze oplossing kan worden bereid op voorhand en opgeslagen bij -20 ° C.
- Bereid een vochtige kamer hybridisatie door het invullen van een kleine plastic opslagcontainer met ongeveer 0,5 in het leidingwater. Deksel container en verwarm tot 60,5 ° C.
- Voeg 2 ml PBSTw aan de putjes van een 24-well plaat cultuur. Plaats monster manden in de gaten van de 24-wells plaat deksel en overdracht weefsel in de korven (tot 10 delen per mand zijn gebruikt).
- Incubeer weefselcoupes voor 30min bij 25 ° C in 6% H 2 O 2. Deze en alle volgende incubaties dient te worden uitgevoerd onder zacht schudden op een rondschudapparaat, tenzij anders aangegeven. Alle incubaties eend wast worden uitgevoerd in 24-well platen en gebruik een totaaloplossing volume van 2mL/well.
- Was weefselcoupes 4 x 5 minuten bij 25 ° C in PBSTw.
- Incubeer weefselcoupes voor 12min bij 25 ° C in PBSTw met 5μg/mL proteinase K.
- Was weefselcoupes 1 x 5 minuten bij 25 ° C in PBSTw.
- Post-fix weefselcoupes voor 20min bij 25 ° C in PBS met 4% paraformaldehyde en 0,2% glutaaraldehyde.
- Was weefselcoupes 2 x 5 minuten bij 25 ° C in PBSTw.
- Voeg 2mL/well van de voorverwarmde prehybridisatie-buffer en incubeer weefsel binnenin vochtig hybridisatie kamer gedurende ten minste 1 uur bij 60,5 ° C.
- Voeg 0.65μg gelabeld riboprobe aan de prehybridisatie-buffer in elk putje en incubeer weefselcoupes 's nachts in de bevochtigde hybridisatie kamer bij 60,5 ° C.
9. In situ hybridisatie Dag 2
- Bereid de volgende oplossingen voor post-hybridisatie wasstappen: Oplossing 1 (50% formamide, 5x SSC, 1% SDS), Oplossing 2 (10mm Tris-HCL pH 7,5, 0,5 M NaCl, 0,1% Tween ™ 20, 0,2 mm natriumazide , 0.22μm gefilterd), en oplossing 3 (2x SSC, 50% formamide). Deze oplossingen kunnen worden bereid op voorhand. Oplossingen 1 en 3 zijn opgeslagen bij -20 ° C en Oplossing 2 wordt bewaard bij 25 ° C. De houdbaarheid van de oplossingen is ten minste 3 maanden.
- Was weefselcoupes 3 X 30 minuten bij 60,5 ° C met voorverwarmd Oplossing 1. Gebruik de bevochtigde kamer tijdens het wassen.
- Was weefselcoupes 1 X 10 minuten bij 60,5 ° C met voorverwarmd Oplossing 1/Solution 2 (1:1 v / v) oplossing. Gebruik de bevochtigde kamer tijdens het wassen.
- Was weefselcoupes 4 X 10 minuten bij 25 ° C met Oplossing 2.
- Incubeer weefsels secties voor 15min bij 37 ° C in Oplossing 2 met 0.25μg/mL RNase.
- Was weefselcoupes 1 X 10 minuten bij 25 ° C met Oplossing 2 (zonder RNase).
- Was weefselcoupes 1 X 10 minuten bij 25 ° C met Oplossing 3, gevolgd door 2 X1hr wasbeurten op 60,5 ° C met Oplossing 3. Gebruik de bevochtigde kamer tijdens de 60,5 ° C wast.
- Bereid de volgende oplossingen voor de immunohistochemische detectie van de DIG-gelabelde riboprobes: Tissue Blocking Buffer (TB, 1x TBS, 10% schapen serum, 1% het blokkeren van reagens, 1% BSA, 0,1% Tween ™ 20, 0.22μm gefilterd), antilichaamverdunning Buffer (AD, 1xTBS, 5% schapen serum, 1% het blokkeren van reagens, 1% BSA, 0,1% Tween ™ 20, 0,2 mm natriumazide, 0,22 m ™ gefilterd) antilichaam Absorptie Buffer (AA, 1xTBS, 5% schapen serum, een % blokkeren van reagens, 1% BSA, 6mg/mL embryo poeder), en TBSTw (1xTBS, 0,1% Tween ™ 20, 0,2 mm natriumazide, 0.22μm gefilterd). Deze oplossingen kunnen worden bereid op voorhand. TBSTw wordt bewaard bij 25 ° C, zijn alle andere oplossingen opgeslagen bij -20 ° C.
- Was 3 X 10 min bij 25 ° C met TBSTw.
- Incubeer de weefselcoupes minstens 2 uur bij 25 ° C in TB buffer.
- Terwijl de weefsels zijn incuberen in TB buffer, voeg 1.1μL anti-DIG antilichaam per 200μL AA buffer voor elk putje. Incubeer AA buffer + antilichaam minstens 2 uur bij 4 ° C en centrifugeer bij 10.000 rpm voor 1 minuut. Verwijder de AA buffer supernatant en voeg deze toe aan 2 ml van AD buffer.
- Verwijderen weefsel uit TB buffer en incubeer ze 's nachts in een vochtige kamer bij 4 ° C in AD buffer met antilichaam.
10. In situ hybridisatie Dag 3
- Bereid kleurontwikkeling oplossing NTMT (100mm Tris-HCL pH 9,5, 100mm NaCl, 50 mM MgCl2, 0,2 mm natriumazide, 0.22μm gefilterd). Deze oplossing kan worden bereid op voorhand en opgeslagen bij 25 ° C. Onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik, voeg 2 mM levamisol en 0,1% Tween ™ 20.
- Verwijder de antilichaam-oplossing (AD buffer + antilichaam) van de putten en op te slaan oplossing bij 4 ° C. Het kan worden hergebruikt maximaal twee extra keer.
- Was de weefsels 8 X 10 min bij 25 ° C met TBSTw met 2 mM levamisol.
- Breng voorzichtig weefsels van de manden naar een petrischaal met TBSTw. Gebruik een tang om zichtbaar vuil te verwijderen. Breng de weefsels in schone microcentrifuge buizen.
- Was de weefsels 1 X 10 min bij 25 ° C met 1 ml NTMT.
- Verwijder de NTMT en voeg 1mL/tube van een mengsel met 50% NTMT (met 2 mM levamisol) en 50% BM Purple, plaats buizen in een licht beschermde doos en incubeer bij 25 ° C. Kleurontwikkeling tijd varieert van enkele uren tot enkele dagen. Als kleur is langzaam te ontwikkelen, kan 100% BM Purple worden gebruikt.
- Monitor kleurontwikkeling en verandering NTMT / BM Paars oplossing als het zich ophoopt neergeslagen kristallen of als het ondergaat kleur veranderen van geel naar paars. Na volledige kleurontwikkeling (4-250 uur), was weefsels 2 X 5 minuten bij 25 ° C met 1mL/tube van NTMT met 2 mM levamisol.
- Incubeer weefsels nacht bij 4 ° C in 1mL/tube PBS, met 4% paraformaldehyde post-fixeermiddel.
- Te bleken de weefsels, incubeer weefsels voor 30min bij 25 ° C in 1mL/tube van PBSTw met 3% H 2 O 2
- Weefselcoupes zijn gemonteerd op glasplaatjes, afgedekt, en afgebeeld met een samengestelde microscoop.
11. Representatieve resultaten:
De ruimtelijke oriëntatie van LUT weefsel in agarose bepaalt het vlak van weefselcoupes. Voor sagittale secties, is ten minste twee derde van de blaas uitgesneden en de resterende LUT weefsel is ingebed in agar zodanig dat de urethrale middellijn is parallel aan het vlakke oppervlak van de agar-plug (Figuur 1A). Kleine aanpassingen in het weefsel vliegtuig kan worden gemaakt door afschuinen de vlakke rand van de agarose stekker. Een vertegenwoordiger sagittale doorsnede van een 17.5dpc mannelijk LUT weefsel dat georiënteerd is op dit vlak is weergegeven in figuur 1B.
Proef manden te beschermen delicate weefsel secties tegen verlies en opeenhoping van stof en deeltjes tijdens de meerdaagse ISH procedure. Monster manden worden voorbereid door het smelten van polyester mesh aan het afgesneden uiteinde van een 1,5 ml microfugebuis (figuur 1C). Een klein gaatje is doorboord in het deksel van elk monster mand naar oplossing doorstroming in en uit de manden. Sample manden worden gesuspendeerd in ISH oplossingen door ze in 12mm gaten geboord in 24-putjes plaat deksels (figuur 1D). De gewijzigde plaat deksels ondersteuning manden als ze worden overgedragen tussen de 24-well platen tijdens de oplossing verandert.
Het is een uitdaging om niet-specifieke achtergrondkleuring te beperken tijdens de lange incubatieperiode nodig voor de detectie van lage overvloed mRNA's. De toevoeging van 0,2 mm natriumazide te proeven buffers en de daaropvolgende filtratie door 0.22μm filters bleek achtergrondkleuring (figuur 2) te beperken. Met behulp van de hier beschreven methode, lijkt er geen te zichtbare verschillen in achtergrond vlekken wanneer monsters worden geïncubeerd in kleurontwikkeling oplossing voor een langere periode (figuur 3).
Figuur 1. Voorbereiding van een muis lagere urogenitale (LUT) luchtwegweefsel sectie en microcentrifugebuis een mand voor ISH. Een LUT met een deel van de blaas, bekken plasbuis en de bijbehorende Wolffian en Mϋllerian duct-afgeleide structuur) is ingebed in een cilindrische stekker van 4% laag-melt agarose. (A) De stekker is verlijmd op een exemplaar montageschijf en (B) gesneden in 50μm secties met een trillende microtoom. (C) Een LUT sectie is overgebracht in een microcentrifugebuis mand die wordt bereid door piercing een gaatje in de buis deksel en de versmelting polyester mesh op het afgesneden onderkant van de buis. (D) De microcentrifugebuis wordt in 12 mm gaten geboord in een 24-wells plaat deksel, zodat weefselcoupes worden gesuspendeerd in bufferoplossing tijdens de ISH-protocol. Pijlpunten geven de LUT weefsel in de agarose stekker.
Figuur 2. Oprichting van 0,2 mm natriumazide in 0.22μm gefilterd oplossingen verbetert de kwaliteit van weefsels en vermindert achtergrondkleuring. 17.5dpc mannelijke muizen een lagere urogenitale traktaten (LUT) werden coupes in een sagittale vlak tot een dikte van 50μm. Weefselcoupes werden gekleurd door ISH met behulp van een probe gericht tegen twist homoloog 1. Buffers worden gebruikt voor het ISH werden ofwel (A) 0.22μm gefilterd en aangevuld met 0,2 mm natriumazide (NaAz) of (B) ongefilterd en niet aangevuld met NaAz. Pijlpunten geven achtergrondkleuring. Beelden werden vastgelegd met dezelfde vergroting. De resultaten zijn representatief kleurpatronen voor n = 3 nest-onafhankelijk muizen.
Figuur 3. Achtergrond kleuringsintensiteit lijkt niet te verhogen met langdurige kleur ontwikkeling. 17.5dpc mannelijke muizen een lagere urogenitale traktaten (LUT) werden coupes in een sagittale vlak tot een dikte van 50μm. Secties werden gekleurd door ISH door het incuberen van hen in chromagen kleuroplossing voor (A) 9.5h met behulp van een sonde die de hoge overvloed transcript oestrogeen-receptor gerelateerde gamma (Esrrg) erkent, (B) voor het 43.5h het gebruik van een sonde die op de middellange overvloed erkent transcript bromodomain grenzend aan zinkvinger domein, 2A (Baz2a), of (C) voor 236h behulp van een sonde die de lage abundantie transcript vleugelloze-type MMTV integratie plaats familie, lid 10 bis (Wnt10a) erkent. Beelden werden vastgelegd met dezelfde vergroting. De resultaten zijn representatief kleurpatronen voor n = 3 nest-onafhankelijk muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van de hier beschreven methode, is het mogelijk om mRNA te detecteren in alle belangrijke soorten cellen en weefsels compartimenten van de foetale mannelijke en vrouwelijke muizen LUT's mogelijk is inclusief de mesenchymale pads, urotheel, glad spierweefsel, prostaat knoppen, ejaculatie kanaal, en de vagina. De 50μm secties die in dit protocol hebben het voordeel dat ze dik genoeg zijn om weefsel architectuur (zoals de bloedvaten) op te lossen, maar zijn dun genoeg om te probe vangen, dat is een methodologisch probleem voorkomende gedurende het hele-mount ISH te vermijden. Elke nieuwe riboprobe wordt beoordeeld op positieve controle weefsel, waar de vlekken is beoordeeld in een eerder gepubliceerde studie. Wij zorgen ervoor dat de kleurpatronen te specifiek zijn in deze weefsels. Een ander voordeel van onze methode is dat de patronen van meerdere mRNA's kan worden beoordeeld in aangrenzende weefsel uit dezelfde LUT weefsel. Bovendien kan deze methode worden gecombineerd met immunohistochemische technieken om cel-specifieke eiwit markers te visualiseren en te celtypen gekleurd door de ISH-protocol te identificeren. Deze methode is onverenigbaar met de traditionele tegenkleuring methoden, zoals nucleaire tegenkleuring met Fast Red of hematoxyline. Maar we hebben met succes tegengekleurd monsters met fluorescerende nucleaire vlekken, waaronder 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en propidiumjodide.
De hier beschreven methode bevat een aantal verbeteringen ten opzichte van een die eerder werd beschreven 7. Bijna alle van de buffers en reagens voorraad oplossingen in de huidige manuscript worden voorbereid op voorhand en kan worden opgeslagen voor lange tijd, waardoor de efficiëntie toeneemt. De toevoeging van 0,2 mm natriumazide de meeste reagentia en hun filtratie door 0.22μm membranen vermindert sterk niet-specifieke achtergrond kleuring, verhoogt reagens shelf-life, en minimaliseert accumulatie van deeltjes op de weefselcoupes tijdens de ISH procedure. Dit manuscript beschrijft ook de fabricage van doorlatende microcentrifugebuis manden die weefselcoupes bevatten tijdens ISH en een aangepaste multi-en cultuur plaat deksel dat de manden houdt tijdens buffer veranderingen. We vonden dat deze apparaten, die gemakkelijk worden vervaardigd in het lab, monster verlies te verminderen, het minimaliseren van weefselsectie schade tijdens de verwerking, en de efficiëntie verbeteren. Bovendien is het gebruik van een afsluitbare plastic container als een bevochtigingskamer helpt bij de bescherming tegen verdamping. Dit is vooral belangrijk voor weefselcoupes in perifere monster putten, waar de zogenaamde 'edge effect' kan een experimentele variabele te introduceren. Tijdens het gebruik van vocht kamers, hebben we niet waargenomen aanzienlijke vlekken kwaliteit van verschillen in perifeer ten opzichte van innerlijke monster putten.
Hoewel dit protocol is een efficiënt mechanisme om mRNA expressie te bestuderen in muizen LUT weefsels, zijn er een aantal beperkingen met deze methode. Efficiëntie van mRNA detectie varieert tussen riboprobes en absolute rijkdom van mRNA's niet kan worden bepaald. Een andere beperking is dat de kleurpatronen kan variëren afhankelijk van de sectie vliegtuig. Te minimaliseren deze beperkingen, beoordelen we elk mRNA patroon in meerdere secties van meerdere nest-onafhankelijk foetussen.
Deze methode kan worden geoptimaliseerd voor het visualiseren van mRNA-expressie patronen in andere muis weefsels soorten of andere soorten. Een dergelijke wijziging vereist dat de microtoom mes amplitude en snelheid worden geoptimaliseerd tijdens het weefsel snijden en dat proteinase K concentratie geoptimaliseerd worden tijdens de ISH procedure. Bovendien is het noodzakelijk om de anti-digoxigenine antilichaam pre-embryo's te absorberen met poeder van dezelfde soort weefsel dat wordt beoordeeld door ISH. Hoewel deze methode is niet bruikbaar voor weefselcoupes dunner dan 40 micron, omdat de onderdelen uit elkaar vallen tijdens de ISH kleuring, kan het worden aangepast voor gebruik in high-throughput hele-mount ISH vlekken. We hebben gebruik gemaakt van deze methode met succes om hele-mount ISH te voeren op foetale en neonatale muis prostaat en foetale gonaden en nieren. Voor de hele-mount ISH kleuring, is het nodig te optimaliseren proteinase K weefsel spijsvertering, alsmede de hoeveelheid en de duur van wast na een nacht antilichaam incubatie op de achtergrond verkleuringen die veroorzaakt zijn door de sonde vangen te verminderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen dr. Lan Yi, Cancer Institute van de New Jersey, bedanken voor technische bijstand bij de voorbereiding van weefsel manden. Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health Subsidies DK083425 en DK070219.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Group | 11214667001 | |
| Blocking reagent | Roche Group | 11096176001 | |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Group | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 | |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Group | 1277073910 | |
| dNTPs | Roche Group | 11969064001 | |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model | |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F5786-1L | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma-Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 | |
| Levamisole | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp | 46551 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375-500G | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 | |
| Millicell culture plate insert | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR | |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 | |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 | |
| Polyester mesh, 33 micron, 12" x 24" | Small Parts, Inc. | CMY-0033-D | |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML | |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 | |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase | |
| RNase | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| RNase inhibitor | Roche Group | 03335399001 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega Corp. | M6101 | |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza Inc. | 50101 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263-500mL | |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 | |
| SSC, 20X solution | Research Products International Corp. | S24022-4000.0 | |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | |
| T7 RNA polymerase | Roche Group | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A | |
| Yeast tRNA | Roche Group | 109495 |
References
- Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
- Rozen, S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).
- Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).
- Vezina, C. M. Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate. Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).
- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
