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Biology

एक उच्च Throughput बगल में संकरण विधि भ्रूण लोअर मूत्रजननांगी माउस पथ में mRNA अभिव्यक्ति पैटर्न विशेषताएँ

Published: August 19, 2011 doi: 10.3791/2912
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Comparative Biosciences, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin-Madison

Summary

यहाँ, हम एक कुशल उच्च throughput का वर्णन

Protocol

1. पीसीआर उत्पन्न टेम्पलेट से Digoxigenin-11-UTP लेबल Riboprobe के संश्लेषण

  1. एक जीन विशिष्ट riboprobe synthesize करने के लिए, Entrez जीन (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) का उपयोग करने के लिए जीन सीडीएनए संदर्भ अनुक्रम (RefSeq) प्राप्त. सीडीएनए अनुक्रम के क्षेत्र 3'के खिलाफ जीन विशिष्ट प्राइमरों पीसीआर डिजाइन Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) कार्यक्रम 5 का प्रयोग करें. पीसीआर प्राइमर चयन के लिए अनुशंसित मापदंडों कहीं वर्णित हैं (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html).
  2. MegaBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090) कार्यक्रम 6 का उपयोग करने के लिए चयनित डीएनए अनुक्रम की विशिष्टता का आकलन. डीएनए अनुक्रम विशिष्ट माना जाता है जब, 0.01 की दहलीज उम्मीद का उपयोग कर, यह RefSeq डेटाबेस में अन्य दृश्यों के साथ संरेखित नहीं करता है.
  3. पीसीआर riboprobe टेम्पलेट बढ़ाना. पीसीआर प्रतिक्रिया घटकों और thermocycling शर्तों प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए अनुकूलित होना चाहिए. एक ठेठ 50 μl प्रतिक्रिया शामिल 1X बफर, 2mm 2 MgCl, 0.2mm dNTPs, 1X क्यू समाधान, 1μg सीडीएनए, 2.5U Taq डीएनए पोलीमरेज़, 0.25μm प्राइमरों, और nuclease मुक्त एच 2 ओ: एक ठेठ thermocycling प्रोटोकॉल 94 में एक प्रारंभिक विकृतीकरण ° 2min के लिए सी 30sec के लिए 94 ° सी के 40 चक्रों के द्वारा पीछा किया, 57 ° सी 30sec के लिए, 72 ° सी 1min और 10min के लिए एक 72 ° C पर अंतिम विस्तार के लिए भी शामिल है. सीडीएनए पीसीआर प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया माउस मूत्रजननांगी mRNA से संश्लेषित है.
  4. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग पीसीआर उत्पाद, जेल निकालना किट का उपयोग कर शुद्ध, और spectrophotometry द्वारा शुद्ध उत्पादों यों. उम्मीद की उपज 1.2 - 3.6μg.
  5. एक लेबल riboprobe में पीसीआर उत्पाद टाइप करना. 400ng शुद्ध पीसीआर उत्पाद, 1X nucleotide लेबलिंग digoxigenin 11-UTP, 1X प्रतिलेखन बफर, 5U RNase अवरोध करनेवाला, 80U T7 शाही सेना पोलीमरेज़, और nuclease मुक्त एच 2 ओ युक्त मिश्रण: प्रतिलेखन प्रतिक्रिया (40 μl) सेते 37 पर 3 4hr डिग्री सेल्सियस और आंदोलन के नमूने हर 30min.
  6. Qiagen RNEASY मिनी किट का उपयोग करने के लिए riboprobes पर स्तंभ DNase पाचन के साथ शाही सेना सफाई के लिए दिए गए निर्देशों के आधार पर शुद्ध. Spectrophotometry द्वारा riboprobes quantitate. उम्मीद की उपज 4-20 μg है. 1.5% गैर - denaturing agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पर एक विभाज्य अलग से जांच की गुणवत्ता का आकलन करें. न्यूनतम smearing के साथ अलग बैंड के रूप में उच्च गुणवत्ता जांच विस्थापित.
  7. Riboprobe विशेष रूप से अपने लक्ष्य को पहचानता है यह सुनिश्चित करने के लिए, पहली ISH प्रयोग के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण ऊतक शामिल हैं. इस सकारात्मक नियंत्रण के ऊतकों में riboprobe के लक्ष्य mRNA पैटर्न ज्ञात होनी चाहिए.

2. हिल सूक्ष्म तक्षणी ब्लेड तैयार (पहले वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर) 7

  1. फॉस्फेट में एक 4% कम पिघल agarose समाधान तैयार buffered खारा (पीबीएस). माइक्रोवेव agarose भंग करने और 62 पर समाधान बनाए रखने के समाधान डिग्री सेल्सियस
  2. 12mm व्यास Millicell संस्कृति की थाली से झिल्ली को हटाने में अच्छी तरह से सम्मिलित करते हैं और polystyrene अंगूठी बनाए रखने के लिए एक agarose मोल्ड के रूप में उपयोग कर एक polystyrene अंगूठी मोल्ड तैयार करें. RNase अवरोध करनेवाला समाधान में रातोंरात के छल्ले प्रत्येक का उपयोग करने के लिए पहले लेना.
  3. पेट्रोलियम ईथर, xylene, क्लोरोफॉर्म, मेथनॉल, और MilliQ पानी: एक चिकनी सतह काटने सुनिश्चित करने, विल्किनसन ब्लेड की सतह से निम्नलिखित सॉल्वैंट्स के साथ rinsing द्वारा जंग अवरोध करनेवाला और अन्य additives, 100% एकाग्रता में निकालना. डबल ब्लेड लंबाई अलग दो एकल ब्लेड में.
  4. लॉकटाइट चिपकने के साथ एक सूक्ष्म तक्षणी ब्लेड विल्किनसन ब्लेड पालन करें. सूक्ष्म तक्षणी ब्लेड काटने के लिए इस्तेमाल नहीं किया है, यह करने के लिए कठोरता विल्किनसन ब्लेड कहते हैं. 4mm - विल्किनसन ब्लेड की धार से सूक्ष्म तक्षणी ब्लेड धातु कैंची और, एक बार पालन का उपयोग विल्किनसन ब्लेड की लंबाई करने के लिए कटौती की जानी चाहिए, 3 द्वारा ऑफसेट किया जाना चाहिए.

3. विच्छेदन, भंडारण, सेक्शनिंग लिए मूत्रजननांगी ऊतकों की तैयारी

  1. PBSTw समाधान तैयार (पीबीएस 0.1% युक्त बीच ™ 20 और 0.2mm सोडियम azide, 0.22μm Stericup के माध्यम से फ़िल्टर्ड ® फिल्टर यूनिट). समाधान अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और 25 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत
  2. एक हौसले से dissected माउस (मूत्राशय, श्रोणि मूत्रमार्ग, और संबद्ध Wolffian और Mϋllerian वाहिनी व्युत्पन्न संरचनाओं) LUT 4 में रातोंरात ° सी पीबीएस में 4% paraformaldehyde लगानेवाला युक्त सेते हैं.
  3. 25 में 10min के लिए धोने ° सी वर्गीकृत मेथनॉल / PBSTw (01:03, 01:01, 03:01 v / v) समाधान की एक श्रृंखला में द्वारा ऊतकों निर्जलीकरण. -20 ° 100% मेथनॉल में कम से कम रातोंरात सी में स्टोर के नमूने. संग्रहीत ऊतकों 2yr कम से कम रखा जा सकता है है.
  4. संग्रहीत ऊतकों rehydrating द्वारा सेक्शनिंग करने के लिए तैयार ऊतकों. 10min के लिए 25 ° सी वर्गीकृत मेथनॉल / PBSTw की एक श्रृंखला में (03:01, 01:01, 01:03 v / v) समाधान पर धो लें.
  5. काटना और मूत्राशय के लगभग दो तिहाई त्यागें, trigone मूत्रमार्ग के लिए संलग्न क्षेत्र के सबसे छोड़कर.
<पी वर्ग = "jove_title"> 4. Agarose में मूत्रजननांगी ऊतक एम्बेडिंग

  1. Polystyrene अंगूठी ढालना, फ्लैट सतह के नीचे एक 25 डिग्री सेल्सियस सादे गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर रखें.
  2. 62 डिग्री सेल्सियस agarose समाधान और 2min के बारे में लिए शांत के साथ रिंग मोल्ड भरें.
  3. PBSTw से LUT ऊतक निकालें और सूखी एक शोषक पोंछ पर दाग.
  4. Agarose समाधान में ऊतक स्थानांतरण.
  5. Agarose में LUT ऊतक इतना है कि यह और रिंग मोल्ड के ऊपर और नीचे के बीच आधे रास्ते निलंबित कर दिया है और 4 पर ऊतक सेते डिग्री सेल्सियस जब तक agarose जम गया है उन्मुख संदंश का प्रयोग करें.
  6. अगर ऊतक agarose solidification की प्रक्रिया के दौरान पूरी तरह से डूब, यह agarose और फिर से एम्बेडेड से excised जा सकता है. Agarose के ठंडा बार के रूप में पुनः एम्बेडिंग प्रक्रिया के दौरान आवश्यक समायोजित.

5. एक हिल सूक्ष्म तक्षणी (पहले वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर) 7 के साथ मूत्रजननांगी ऊतक सेक्शनिंग

  1. हिल सूक्ष्म तक्षणी में प्रबलित विल्किनसन ब्लेड पर्वत और ब्लेड कोण 35 ° करने के लिए सेट. पीबीएस और पैक नमूना स्नान के आसपास गीला बर्फ के साथ डीलक्स नमूना स्नान भरें.
  2. रिंग मोल्ड से जम agarose प्लग निकालें और एक शोषक पोंछ के साथ नीचे की सतह दाग. सत्यापित करें कि ऊतक सही ढंग से उन्मुख है. ऊतकों उन्मुखीकरण एक धार agarose प्लग के फ्लैट बढ़त बेवल का उपयोग करने के लिए द्वारा समायोजित किया जा सकता है.
  3. एक हिल सूक्ष्म तक्षणी लॉकटाइट के रूप में छवि में दिखाया गया चिपकने के साथ डिस्क बढ़ते नमूना पर agarose प्लग का पालन करें. 1A.
  4. Vibratome में नमूना बढ़ते डिस्क डालें.
  5. 50μm, 2 करने के लिए गति, और ब्लेड आयाम 4 करने के लिए सूक्ष्म तक्षणी अनुभाग मोटाई और समायोजित ऊतक वर्गों को काटने शुरू करते हैं.
  6. कुंद संदंश का प्रयोग एक संस्कृति 24 अच्छी तरह से अच्छी तरह से थाली है कि ठंडा 0.5ml PBSTw होता प्रत्येक ऊतक खंड (छवि 1B) हस्तांतरण .
  7. के लिए नमूने स्वस्थानी संकरण, आबकारी में लगभग प्रत्येक ऊतक अनुभाग (शेष agarose ISH प्रक्रिया के दौरान पिघल जाएगा) agarose का सबसे तैयार है और सभी संबद्ध मलबे को हटाने के लिए. 48hr के लिए स्टोर 4 बजे ° वर्गों PBSTw में सी.

6. नमूना स्वस्थानी संकरण में बास्केट के लिए तैयार

  1. 100μL निशान पर एक microcentrifuge ट्यूब के नीचे कट.
  2. एक लौ में ट्यूब की कटौती बढ़त हीट जब तक प्लास्टिक नरम है, तो एक 0.5in पॉलिएस्टर जाल वर्ग के केंद्र पर मजबूती से microcentrifuge ट्यूब दबाएँ.
  3. अतिरिक्त जाल छाँटो और पियर्स दो छेद प्रत्येक ट्यूब ढक्कन में एक गर्म 18 गेज सुई टोकरी की तैयारी (छवि 1C) को पूरा करने के लिए उपयोग.
  4. एक 24 अच्छी तरह से थाली के ढक्कन हटाएँ और एक 12mm प्रत्येक अच्छी तरह से अधिक केंद्रित छेद ड्रिल. ढक्कन प्रयोग ISH प्रोटोकॉल के washes (छवि 1D) के बीच नमूना टोकरी हस्तांतरण .

7. भ्रूण स्वस्थानी संकरण में पाउडर के लिए तैयार (पहले वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर) 8

  1. चूहों कि ऊतक वर्गों है कि मूल्यांकन किया जा रहा है और -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस के रूप में एक ही चरण से माउस भ्रूण ऊतक लीजिए एक चीनी मिट्टी मोर्टार, तरल नाइट्रोजन में डूब ऊतक में जमे हुए ऊतक प्लेस, और एक पैर का उपयोग करने के लिए एक ठीक पाउडर में ऊतक पीसने.
  2. एसीटोन के 4 संस्करणों के साथ भ्रूण पाउडर का मिश्रण है और एक dounce homogenizer के कई स्ट्रोक के साथ homogenize.
  3. एक 15ml पेंच शीर्ष शीशी कांच homogenate स्थानांतरण और 4 में रात भर निकालने ° सी.
  4. गोली 10min के लिए 5000rpm पर centrifugation द्वारा 4 में भ्रूण पाउडर डिग्री सेल्सियस निकालें और लिपिड युक्त सतह पर तैरनेवाला त्यागने. Resuspend 4vol ताजा एसीटोन में गोली ऊतक और 2hr में 4 के लिए निकालने डिग्री सेल्सियस
  5. 5000rpm पर centrifugation द्वारा 10min के लिए 4 में भ्रूण पाउडर गोली डिग्री सेल्सियस निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  6. एयर वाटमान # 2 फिल्टर पेपर पर गोली सूखी. गोली क्रश 4 में एक ठीक है और एक कसकर मोहरबंद ग्लास शीशी में पाउडर दुकान उपज डिग्री सेल्सियस अनुमानित उपज प्रति 1 ग्राम भ्रूण गीला वजन 50 मिलीग्राम पाउडर है.

स्वस्थानी संकरण एक दिन में 8.

  1. पहले से गरम prehybridization 60.5 का हल (50% formamide, 5x एसएससी, 1% अवरुद्ध अभिकर्मक, 10μg/mL खमीर tRNA, 10μg/mL -20 में हेपरिन दुकान डिग्री सेल्सियस) डिग्री सेल्सियस यह समाधान अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत
  2. लगभग 0.5 के साथ पानी के नल में एक छोटा सा प्लास्टिक का भंडारण कंटेनर को भरने के द्वारा एक humidified संकरण कक्ष तैयार करें. 60.5 सी. सेंटीग्रेड कंटेनर और पहले से गरम कवर
  3. संस्कृति 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं 2ml PBSTw जोड़ें. प्लेस 24 अच्छी तरह से थाली और टोकरी (टोकरी प्रति करने के लिए 10 वर्गों का इस्तेमाल किया गया है) में ढक्कन हस्तांतरण ऊतक वर्गों के छेद में नमूना टोकरी.
  4. 30min के लिए 25 में ऊतक वर्गों सेते ° सी में 6% एच 2 2 हे . यह और बाद के सभी incubations एक कक्षीय हिलनेवाला पर कोमल आंदोलन के साथ बाहर किया जाना चाहिए, जब तक अन्यथा इंगित. सभी एक incubationsघ washes 24 अच्छी तरह प्लेटें में आयोजित कर रहे हैं और 2mL/well की कुल समाधान मात्रा का उपयोग करें.
  5. ऊतक वर्गों 25 ° सी PBSTw में 4 5min एक्स धो.
  6. 25 में 12min के लिए ऊतक वर्गों सेते ° सी PBSTw में 5μg/mL proteinase लालकृष्ण युक्त
  7. ऊतक वर्गों 25 ° सी PBSTw में 1 5min एक्स धो.
  8. डाक तय 20min ऊतक वर्गों के लिए 25 ° सी पीबीएस में 4% और 0.2% paraformaldehyde glutaraldehyde युक्त.
  9. ऊतक वर्गों 2 x 25 में 5min ° सी PBSTw में धो डालें.
  10. Prewarmed prehybridization बफर के 2mL/well जोड़ें और 60.5 पर कम से कम 1hr humidified संकरण चैम्बर डिग्री सेल्सियस के अंदर ऊतक वर्गों सेते
  11. Prehybridization बफर प्रत्येक अच्छी तरह से और सेते ऊतक वर्गों humidified संकरण कक्ष में रात भर में 60.5 0.65μg लेबल riboprobe जोड़ें डिग्री सेल्सियस

9. स्वस्थानी संकरण दिन में 2

  1. समाधान: 1 (50% formamide, 5x एसएससी, 1% एसडीएस), 2 समाधान (10mm Tris - एचसीएल 7.5 पीएच, 0.5m NaCl, 0.1% बीच ™ 20, 0.2mm सोडियम azide के बाद संकरण धोने कदम के लिए निम्न समाधानों तैयार फ़िल्टर 0.22μm), और 3 समाधान (2x एसएससी, formamide 50%). ये समाधान अग्रिम में तैयार किया जा सकता है. समाधान 1 और 3 -20 डिग्री सेल्सियस और समाधान 2 में संग्रहीत किए जाते हैं 25 में संग्रहीत किया जाता है डिग्री सेल्सियस भंडारण समाधान के जीवन में कम से कम 3 महीने है.
  2. ऊतक वर्गों 60.5 पर 3 30min एक्स धो डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म एक समाधान के साथ. Washes के दौरान humidified चैम्बर का उपयोग करें.
  3. ऊतक वर्गों 60.5 पर 1 10min एक्स धो डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म समाधान 2 1/Solution (01:01 v / v) समाधान के साथ. धोने के दौरान humidified कक्ष का उपयोग करें.
  4. ऊतक वर्गों समाधान के साथ 2 4 10min एक्स धो 25 डिग्री सेल्सियस.
  5. 37 के लिए 15min ऊतकों वर्गों सेते ° सी समाधान में 2 युक्त 0.25μg/mL RNase.
  6. ऊतक वर्गों 25 में 1 10min एक्स धो ° सी (RNase बिना) के समाधान के साथ 2.
  7. ऊतक वर्गों 25 में 1 10min एक्स धो ° सी समाधान के साथ 3, 2 X1hr द्वारा पीछा 3 समाधान के साथ 60.5 ° सी में washes. 60.5 ° सी washes के दौरान humidified कक्ष का उपयोग करें.
  8. डीआईजी लेबल riboprobes के immunohistochemical पता लगाने के लिए निम्न समाधानों को तैयार: ऊतक अवरुद्ध बफर (टीबी, 1X TBS, 10% भेड़ सीरम,% 1 अवरुद्ध अभिकर्मक,% 1 BSA, 0.1% बीच 20 ™, 0.22μm फ़िल्टर), एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर (ई., 1xTBS, 5% भेड़ सीरम,% 1 अवरुद्ध अभिकर्मक,% 1 BSA, 0.1% बीच ™ 20, 0.2mm सोडियम azide, 0.22 मीटर फ़िल्टर ™) एंटीबॉडी अवशोषण बफर (ए.ए., 1xTBS, 5% भेड़ सीरम, 1 % अवरुद्ध अभिकर्मक, 1% BSA, 6mg/mL भ्रूण पाउडर), और TBSTw (1xTBS, 0.1% बीच ™ 20, 0.2mm सोडियम azide, 0.22μm फ़िल्टर). ये समाधान अग्रिम में तैयार किया जा सकता है. TBSTw 25 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है, अन्य सभी समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कर रहे हैं
  9. 25 में 3 एक्स 10 मिनट ° सी TBSTw के साथ धोएं.
  10. कम से कम 25 2hr ° टीबी बफर में सी ऊतक वर्गों सेते हैं.
  11. जबकि ऊतकों टीबी बफर में incubating रहे हैं, 200μL ए.ए. बफर प्रति प्रत्येक के लिए अच्छी तरह 1.1μL विरोधी डीआईजी एंटीबॉडी जोड़ें. सेते ए.ए. बफर + एंटीबॉडी कम से कम 2hr पर 4 डिग्री सेल्सियस, तो 1min के लिए 10,000 rpm पर अपकेंद्रित्र. ए.ए. बफर सतह पर तैरनेवाला निकालें और यह ई. बफर के 2ml जोड़ने.
  12. टीबी बफर से ऊतक वर्गों निकालें और उन्हें 4 पर एक humidified कक्ष में रात में सेते डिग्री सेल्सियस ई. एंटीबॉडी युक्त बफर में.

स्वस्थानी संकरण दिन में 10 3

  1. रंग विकास समाधान NTMT (100mm Tris - एचसीएल 9.5 पीएच, 100mm NaCl, 50mm 2 MgCl, 0.2mm सोडियम azide, फ़िल्टर 0.22μm) तैयार करें. यह समाधान अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और 25 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत तुरंत उपयोग से पहले, 2mm levamisole जोड़ने और 0.1% बीच ™ 20.
  2. कुओं और दुकान समाधान 4 डिग्री सेल्सियस से एंटीबॉडी समाधान निकालें (ई. बफर + एंटीबॉडी) यह दो अतिरिक्त समय के लिए reused किया जा सकता है.
  3. 25 ऊतकों 8 एक्स 10 मिनट धो ° सी TBSTw साथ 2mm levamisole युक्त.
  4. ध्यान से टोकरी से ऊतकों एक पेट्री TBSTw युक्त पकवान करने के लिए स्थानांतरण. संदंश का प्रयोग करें दिखाई मलबे को हटाने. साफ microcentrifuge ट्यूबों में ऊतकों का स्थानांतरण.
  5. ऊतकों से 25 पर 1 X 10 मिनट ° सी के साथ 1ml NTMT धो लें.
  6. NTMT निकालें और एक प्रकाश संरक्षित बॉक्स और सेते में से 25 पर 50% (2mm levamisole युक्त) NTMT और 50% बी.एम. बैंगनी, जगह ट्यूबों युक्त मिश्रण का 1mL/tube डिग्री सेल्सियस जोड़ने रंग विकास के समय में कई घंटे से कई दिनों तक पर्वतमाला. अगर रंग को विकसित करने के लिए धीमी है, 100% बी.एम. बैंगनी इस्तेमाल किया जा सकता है.
  7. मॉनिटर कलर विकास और परिवर्तन NTMT / बी.एम. पर्पल समाधान अगर यह उपजी क्रिस्टल जम जाता है या अगर यह बैंगनी रंग के लिए पीले रंग से रंग बदलाव आए. (4-250 घंटे) के पूर्ण रंग के विकास के बाद, धोने ऊतकों 5min 2 25 एक्स ° सी युक्त NTMT 2mm levamisole के 1mL/tube साथ.
  8. 4 में रात भर ऊतकों सेते ° सी पीबीएस के 1mL/tube में 4% के बाद लगानेवाला paraformaldehyde युक्त.
  9. ब्लीच ऊतकों, 25 में 30min के लिए सेते ऊतकों ° सी PBSTw के 1mL/tube में 3% एच 2 2 हे युक्त
  10. ऊतक वर्गों गिलास स्लाइड पर बढ़ रहे हैं, coverslipped, और एक यौगिक खुर्दबीन के साथ imaged.

11. प्रतिनिधि परिणाम:

agarose में LUT ऊतक के स्थानिक उन्मुखीकरण ऊतक वर्गों के विमान निर्धारित करता है. बाण के समान अनुभागों के लिए, मूत्राशय के कम से कम दो तिहाई excised है और शेष LUT ऊतक में ऐसी है कि मूत्रमार्ग midline agarose प्लग (चित्र 1 ए) के फ्लैट सतह के समानांतर है अगर एम्बेडेड है. ऊतक विमान में मामूली समायोजन agarose प्लग के फ्लैट बढ़त beveling द्वारा बनाया जा सकता है. एक 17.5dpc पुरुष LUT ऊतक से एक प्रतिनिधि बाण के समान अनुभाग है कि इस विमान में उन्मुख है चित्रा 1 बी में दिखाया गया है .

नमूना बास्केट नुकसान से और बहु ​​दिन ISH प्रक्रिया के दौरान धूल और बात कण जमते से नाजुक ऊतकों वर्गों की रक्षा करना. नमूना टोकरी 1.5mL microfuge ट्यूब (चित्रा 1C) की कटौती समाप्त करने के लिए पॉलिएस्टर जाल पिघलने से तैयार हैं. एक छोटे से छेद में और बाहर टोकरी के समाधान के प्रवाह को सुविधाजनक बनाने के प्रत्येक नमूना टोकरी के ढक्कन में छेदा है. नमूना टोकरी ISH समाधान में 12mm 24 अच्छी तरह से थाली lids (चित्रा 1D) में drilled छेद में उन्हें रखने के द्वारा निलंबित कर रहे हैं . संशोधित थाली lids टोकरी जब वे 24 अच्छी तरह से प्लेटों के बीच समाधान परिवर्तन के दौरान स्थानांतरित कर रहे हैं का समर्थन करते हैं.

यह कम बहुतायत mRNAs का पता लगाने के लिए आवश्यक लंबी ऊष्मायन अवधि के दौरान गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला सीमा चुनौतीपूर्ण है. 0.22μm फिल्टर के माध्यम से 0.2mm सोडियम नमूना बफ़र्स azide और उनके बाद छानने का काम के अलावा करने के लिए पृष्ठभूमि धुंधला (चित्रा 2) सीमा दिखाई दिया. विधि यहाँ वर्णित का प्रयोग, वहाँ के लिए पृष्ठभूमि धुंधला में दिखाई मतभेद हो सकता है जब नमूने रंग विकास के समाधान में एक लंबे समय अवधि (चित्रा 3) के लिए incubated रहे हैं प्रकट नहीं होता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 माउस कम मूत्रजननांगी (LUT) पथ ऊतक अनुभाग और microcentrifuge ट्यूब ISH के लिए एक टोकरी की तैयारी. एक LUT मूत्राशय, श्रोणि मूत्रमार्ग और संबद्ध Wolffian और Mϋllerian संरचना वाहिनी व्युत्पन्न) का हिस्सा युक्त 4% के कम पिघल agarose के एक बेलनाकार प्लग में एम्बेडेड है. (ए) प्लग एक नमूना बढ़ते डिस्क के लिए सरेस से जोड़ा हुआ है और (ख) एक हिल सूक्ष्म तक्षणी के साथ 50μm वर्गों में कटौती. (सी) एक LUT अनुभाग microcentrifuge ट्यूब टोकरी है कि ट्यूब ढक्कन और कटौती नीचे अंत करने के लिए ट्यूब के fusing पॉलिएस्टर जाल में एक छेद छेदने द्वारा तैयार की है में स्थानांतरित किया है. (डी) microcentrifuge ट्यूब 12mm 24 अच्छी तरह से एक थाली ढक्कन में drilled इतना है कि ऊतक वर्गों बफर समाधान में ISH प्रोटोकॉल के दौरान निलंबित कर रहे हैं छेद में डाला जाता है. Arrowheads agarose प्लग में LUT ऊतक से संकेत मिलता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. 0.22μm फ़िल्टर समाधान में 0.2mm सोडियम azide के निगमन ऊतक गुणवत्ता में सुधार और पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना कम कर देता है. 17.5dpc पुरुष माउस कम मूत्रजननांगी इलाकों (LUTs) 50μm की एक मोटाई के लिए एक बाण के समान विमान में sectioned थे. ऊतक वर्गों एक मोड़ homolog एक के खिलाफ निर्देशित जांच का उपयोग ISH द्वारा दाग थे. ISH के लिए इस्तेमाल किया Buffers या तो थे (ए) 0.22μm फ़िल्टर और 0.2mm सोडियम azide (नाज़) के साथ पूरक या (बी) अनफ़िल्टर्ड और नहीं नाज़ के साथ पूरक है. Arrowheads पृष्ठभूमि धुंधला संकेत मिलता है. छवियाँ एक ही बढ़ाई पर कब्जा कर लिया गया. परिणाम n = 3 कूड़े स्वतंत्र चूहों के लिए प्रतिनिधि धुंधला पैटर्न हैं .

चित्रा 3
चित्रा पृष्ठभूमि 3. धुंधला तीव्रता के लंबे समय तक रंग विकास के साथ वृद्धि प्रकट नहीं होता है . 17.5dpc पुरुष माउस कम मूत्रजननांगी इलाकों (LUTs) 50μm की एक मोटाई के लिए एक बाण के समान विमान में sectioned थे. धारा ISH द्वारा उन्हें chromagen धुंधला समाधान में incubating द्वारा (ए) 9.5h एक जांच है कि उच्च बहुतायत प्रतिलेख एस्ट्रोजन से संबंधित रिसेप्टर गामा (Esrrg) को मान्यता का उपयोग कर, (बी) 43.5h के लिए एक जांच है कि मध्यम बहुतायत पहचानता का उपयोग करने के लिए दाग थे प्रतिलेख bromodomain जस्ता उंगली डोमेन के लिए आसन्न, (Baz2a) 2A, या (सी) 236h एक जांच है कि कम बहुतायत wingless प्रकार प्रतिलेख MMTV एकीकरण साइट परिवार, सदस्य 10a (Wnt10a) को मान्यता का उपयोग कर के लिए. छवियाँ एक ही बढ़ाई पर कब्जा कर लिया गया. परिणाम n = 3 कूड़े स्वतंत्र चूहों के लिए प्रतिनिधि धुंधला पैटर्न हैं .

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Discussion

पद्धति का उपयोग करके यहाँ वर्णित है, यह संभव है के सभी प्रमुख प्रकार की कोशिकाओं और भ्रूण पुरुष और महिला mesenchymal पैड, urothelium, चिकनी पेशी, prostatic कलियों, उद्गार वाहिनी, और योनि सहित माउस LUTs के ऊतक डिब्बों में mRNAs का पता लगाने. 50μm इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया वर्गों काफी मोटी ऊतक वास्तुकला (जैसे रक्त वाहिकाओं के रूप में) को हल किया जा रहा का लाभ है, लेकिन काफी पतली जांच फँसाने, जो एक methodological सामान्यतः पूरे माउंट ISH के दौरान समस्या का सामना करना पड़ा है से बचने के कर रहे हैं. हर नए riboprobe सकारात्मक नियंत्रण ऊतक पर मूल्यांकन किया है, जहां धुंधला पिछले एक प्रकाशित एक अध्ययन में मूल्यांकन किया गया है. हमें यह सुनिश्चित करना है कि धुंधला हो जाना पैटर्न इन ऊतकों में विशिष्ट हैं. हमारे विधि का एक अन्य लाभ यह है कि कई mRNAs का पैटर्न ही LUT ऊतकों से आसन्न ऊतकों वर्गों में मूल्यांकन किया जा सकता है. इसके अलावा, इस विधि immunohistochemical तकनीक के साथ युग्मित किया जा सेल विशिष्ट प्रोटीन मार्कर कल्पना और सेल ISH प्रोटोकॉल द्वारा दाग प्रकार की पहचान कर सकते हैं. इस विधि फास्ट लाल या hematoxylin के साथ परमाणु counterstaining जैसे पारंपरिक counterstaining विधियों, के साथ असंगत है. हालांकि, हम 4 सहित फ्लोरोसेंट परमाणु दाग ​​'(DAPI) ,6-diamidino-2 - phenylindole और propidium आयोडाइड के साथ सफलतापूर्वक counterstained नमूने है.

विधि यहाँ वर्णित है कि पहले 7 में वर्णित किया गया है पर कई सुधार भी शामिल है . और buffers वर्तमान पांडुलिपि में अभिकर्मक शेयर समाधान के लगभग सभी अग्रिम में तैयार कर रहे हैं और समय की लंबी अवधि है, जो क्षमता बढ़ जाती है के लिए भंडारित किया जा सकता है. 0.2mm सोडियम azide के सबसे 0.22μm झिल्ली के माध्यम से और उनके निस्पंदन अभिकर्मकों के अलावा बहुत गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला घटता है, ISH प्रक्रिया के दौरान ऊतक वर्गों पर बात कण के अभिकर्मक शैल्फ जीवन, और कम से कम संचय बढ़ जाती है. यह पांडुलिपि भी पारगम्य microcentrifuge ट्यूब बास्केट कि ISH और एक संशोधित संस्कृति बहु - अच्छी तरह से थाली ढक्कन कि बफर परिवर्तन के दौरान बास्केट धारण के दौरान ऊतक वर्गों शामिल के निर्माण का वर्णन करता है. हमने पाया है कि इन उपकरणों, जो आसानी से प्रयोगशाला में निर्मित कर रहे हैं नमूना हानि को कम करने, प्रसंस्करण के दौरान ऊतक अनुभाग नुकसान को कम करने के लिए, और दक्षता में सुधार. इसके अलावा, एक आर्द्रता चैम्बर के रूप में एक sealable प्लास्टिक कंटेनर के उपयोग के वाष्पीकरण के खिलाफ की रक्षा में मदद करता है. यह परिधीय नमूना कुओं, जहां तथाकथित 'बढ़त प्रभाव' एक प्रयोगात्मक चर शुरू कर सकते हैं ऊतक वर्गों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. जबकि नमी कक्षों का उपयोग कर, हम परिधीय बनाम भीतरी नमूना कुओं में प्रशंसनीय धुंधला गुणवत्ता मतभेद नहीं देखा है.

जबकि इस प्रोटोकॉल के लिए माउस LUT ऊतकों में mRNA अभिव्यक्ति पैटर्न के अध्ययन के लिए एक कुशल व्यवस्था है, वहाँ इस विधि के साथ कुछ सीमाएं हैं. MRNA का पता लगाने की क्षमता riboprobes और mRNAs का निरपेक्ष बहुतायत के बीच बदलता है निर्धारित नहीं किया जा सकता है. एक और सीमा है कि धुंधला हो जाना पैटर्न अनुभाग विमान के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. इन सीमाओं को कम करने के लिए, हम कई कूड़े स्वतंत्र भ्रूण से एकाधिक अनुभागों में प्रत्येक mRNA पैटर्न का आकलन करें.

इस विधि अन्य माउस ऊतक प्रकार या अन्य प्रजातियों में mRNA अभिव्यक्ति पैटर्न को दृश्यमान करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस तरह के संशोधन की आवश्यकता है कि सूक्ष्म तक्षणी ब्लेड आयाम और गति ऊतक सेक्शनिंग के दौरान अनुकूलित किया जाना है कि proteinase कश्मीर एकाग्रता ISH प्रक्रिया के दौरान अनुकूलित किया जा. इसके अलावा, यह आवश्यक है कि ISH द्वारा मूल्यांकन किया जा रहा है ऊतक के एक ही प्रजाति से भ्रूण पाउडर के साथ विरोधी - digoxigenin एंटीबॉडी पूर्व अवशोषित. हालांकि इस पद्धति ऊतक वर्गों 40 माइक्रोन से पतले के लिए उपयोगी नहीं है, क्योंकि वर्गों ISH धुंधला दौरान बिखर, यह उच्च throughput ISH पूरे माउंट धुंधला में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हम इस विधि का इस्तेमाल किया है सफलतापूर्वक के रूप में अच्छी तरह से भ्रूण जननपिंड और गुर्दे के रूप में भ्रूण और नवजात माउस प्रोस्टेट पर पूरे माउंट ISH आचरण. पूरे माउंट ISH धुंधला के लिए, यह आवश्यक है proteinase कश्मीर ऊतक पाचन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रातोंरात एंटीबॉडी के लिए पृष्ठभूमि जांच फँसाने के कारण धुंधला हो जाना कम ऊष्मायन के बाद washes की मात्रा और अवधि का अनुकूलन.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों के लिए तकनीकी सहायता के लिए ऊतक टोकरी तैयारी में डा. Lan यी, न्यू जर्सी के कैंसर संस्थान, शुक्रिया अदा करना चाहूँगा. यह काम स्वास्थ्य DK083425 और DK070219 अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments Roche Group 11214667001
Blocking reagent Roche Group 11096176001
BM Purple AP substrate, precipitating Roche Group 11442074001
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Cell culture plate, 24 well Corning 3524
Digoxigenin 11-UTP Roche Group 1277073910
dNTPs Roche Group 11969064001
Double-edged razor blade Wilkinson Sword Classic Model
Eliminase RNase remover Decon Laboratories 1102
Formamide Sigma-Aldrich F5786-1L
Gel extraction kit Qiagen 28704
Glutaraldehyde, 25% solution in H2O Sigma-Aldrich G6257-100ML
Heparin, sodium salt Sigma-Aldrich H3393
Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O Fisher Scientific BP2633-500
Levamisole Sigma-Aldrich L9756
Loctite 404 quick set instant adhesive Henkel Corp 46551
Magnesium chloride Fisher Scientific M33-500
Maleic acid Sigma-Aldrich M0375-500G
Microcentrifuge tubes, 1.5mL Biologix Research Company BP337-100
Millicell culture plate insert EMD Millipore PICM01250
Molecular grinding resin G-Biosciences 786-138PR
Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline Affymetrix 19943
Phosphate buffered saline, without Ca & Mg MP Biomedicals ICN1760420
Polyester mesh, 33 micron, 12" x 24" Small Parts, Inc. CMY-0033-D
Proteinase K solution, 20mg/ml Amresco E195-5ML
QIAshredder Columns Qiagen 79654
Q solution Qiagen Provided with Taq DNA polymerase
RNase Sigma-Aldrich R6513
RNase inhibitor Roche Group 03335399001
RNeasy mini kit Qiagen 74104
RNEASY mini kit Qiagen 74104
RQ1 RNase-free DNase Promega Corp. M6101
SeaPlaque low-melt agarose Lonza Inc. 50101
Sheep serum Sigma-Aldrich S2263-500mL
Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL EMD Millipore SCGPU05RE
Sodium azide, granular Fisher Scientific S227I-100
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific S529-500
SSC, 20X solution Research Products International Corp. S24022-4000.0
SuperScript III first-strand synthesis system Invitrogen 18080-051
T7 RNA polymerase Roche Group 10881767001
Taq DNA polymerase Qiagen 201203
Tris-HCl Fisher Scientific BP153-1
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Vibrating microtome with deluxe specimen bath Leica Microsystems VT1000A
Yeast tRNA Roche Group 109495

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References

  1. Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
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  3. Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
  4. Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
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  6. Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).
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  8. Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).

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विकास जीवविज्ञान 54 अंक मूत्रजननांगी प्रोस्टेट निचले मूत्रपथ स्वस्थानी संकरण में मूत्रमार्ग,
एक उच्च Throughput<em> बगल में</em> संकरण विधि भ्रूण लोअर मूत्रजननांगी माउस पथ में mRNA अभिव्यक्ति पैटर्न विशेषताएँ
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Abler, L. L., Mehta, V., Keil, K.… More

Abler, L. L., Mehta, V., Keil, K. P., Joshi, P. S., Flucus, C., Hardin, H. A., Schmitz, C. T., Vezina, C. M. A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract. J. Vis. Exp. (54), e2912, doi:10.3791/2912 (2011).

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