사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation
Summary
utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.
Abstract
유전자 표현을 조작할 수있는 능력은 여러 개발 경로의 해설로 이어지는, 현대 실험 발생학의 초석입니다. 몇몇 강력하고 잘 설립된 유전자 변형 기술은 모두 손실과 이득의 기능 모델의 생성을 허용, 마우스의 유전자 발현 수준을 조작하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나, 마우스 트렌스 제닉의 세대 비용과 시간이 소요 모두이다. 유전자 조작의 대체 방법을 따라서 넓게 모색하고 있습니다. utero에 electroporation 우리가 성공적으로 3,4을 적응 가지고 살고 마우스 배아의 1,2에 유전자 전달의 방법입니다. 그것은 크게 일반적으로 여자는 5에서 사용되는 비켜 electroporation 기술의 성공을 기반으로합니다. 간단히, DNA는 세포로 DNA의 이해 수있게 개발 두뇌와 전류가 발생 세포 점막에 일시 모공의 형성 응용 프로그램의 열려있는 심실로 주입됩니다. 젊은 태아의 타겟팅 초음파 유도 microinjection 프로토콜로 이전 6 설명을 필요로하는 동안 우리 손에, 배아는 효율적으로 배아 일 (E) 11.5 빠르면 electroporated 수 있습니다. 반대로, E15.5은 두정 골과 두뇌에 microinjection을 초래할 이마 뼈 분화의 발병으로 인해 우리가 쉽게 electroporate 수있는 최신 단계이다. 반대로, 망막은 embryogenesis의 끝 부분을 통해 액세스할 수 있습니다. 배아는 배아 또는 출생 후의 초기 기간 동안 어떤 시점에서 수집한 수 있습니다. 기자 구조의 주사 transfected 세포의 식별을 용이하게합니다.
날짜하려면, utero의 electroporation에서 가장 널리 neocortical 개발 1,2,3,4의 분석에 사용되고 있습니다. 최근 연구는 배아 망막 7, 8, 9 및 시상 10,11,12를 타겟으로합니다. 여기, 우리는 쉽게 배아 CNS의 다른 도메인을 대상으로 적용할 수 있습니다 utero의 electroporation 프로토콜의 수정을 제시한다. 우리는이 기술을 사용하여 우리가 배아 telencephalon, diencephalon과 망막을 대상 수있는 증거를 제공합니다. 대표 결과가 처음 우리가 배아 telencephalon의 전구 성숙, 분화 및 마이 그 레이션을 모니터링 수 있도록 측면 심실로의 DNA 구조 표현을 소개하는이 방법의 사용을 보여주는 제공됩니다. 우리는 또한 모니터링하는 diencephalic 핵에 신경을 차별의 철새 경로를 허용,이 기술은 제 3의 뇌실 주위 diencephalic 지역에 DNA를 대상으로하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 우리는 우리가 망막 개발에 유전자 발현을 조작의 효과를 분석 있도록 micromanipulators의 사용 우리가 정확하게 subretinal 공간을 포함하는 작은 대상 분야로 DNA 구조를 소개하는 허용 보여줍니다.
Protocol
Discussion
utero에 electroporation은 개발 프로세스의 다양한 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, GFP, mCherry 또는 알칼리성 인산 가수 분해 효소와 같은 기자 유전자의 transfection은 혈통의 연결을 추적 및 마이 그 레이션 실험을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 또는, Cre 호텔 recombinase는 transiently 선택 공간 및 / 또는 temporally 제어 방식으로 floxed allele를 제거하는 표현하실 수 있습니다. 또한, shRNA ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 CS 실험실에서 utero의 electroporation 기술의 확립에서 초기 작업에 에바 Hadzimova, 피에르 Mattar과 크리스토퍼 코바치 감사하고 싶습니다. 이 작품은 캐나다 보건 연구소 연구소 (CIHR) 부여 (청소 44,094)과 DMK에 CS와 알버타 아동 병원 연구 재단 부여 팀 그랜트 (00933-000)을 신흥 CIHR / 재단 파이팅 실명 (FFB)에 의해 재정 지원되었다. RD가 CIHR 캐나다 희망 장학금 지원 되었음 RC는 FFB의 학생이기 지원하고 LML은 유전학에 CIHR 교육 그랜트와 아동 발달 지원했다.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Category |
|---|---|---|---|
| Fine scissors | Fine Science Tools Inc. | 14078-10 | Surgical Tools |
| Iris scissors, curved | Fine Science Tools Inc. | 14061-10 | Surgical Tools |
| Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder | Fine Science Tools Inc. | 12002-12 | Surgical Tools |
| Ring forceps, 9mm | Fine Science Tools Inc. | 11103-09 | Surgical Tools |
| Eye dressing Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11051-10 | Surgical Tools |
| Dumont #7 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont #5 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11251-30 | Surgical Tools |
| Tissue forcep-Adson | Fine Science Tools Inc. | 11027-12 | Surgical Tools |
| Reflex Clip Applier | World Precision Instrument | 500343 | Surgical Tools |
| Perforated Spoon, 15 mm diameter | Fine Science Tools Inc. | 10370-18 | Surgical Tools |
| Autoclip Remover | Mikron | 427637 | Surgical Tools |
| Silk Black Braided Suture | Ethicon Inc. | K871 | Surgical Tools |
| Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips | World Precision Instruments | 500346 | Surgical Tools |
| ECM 830 Square Wave Electroporation System | VWR-CanLab | 58018-004 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P7 | Instruments |
| Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CA62111-488 | Instruments |
| Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CAACCESS (misc.) | Instruments |
| Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH | VWR CanLab | CA33995-534 CPN-952-118 | Instruments |
| Sutter P97 Micropipet Puller | Sutter Instrument, Carsen Group Inc. | P-97 | Instruments |
| Micropipettes – Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-78-10 | Instruments |
| 3-Axis Coarse Manipulator | Carl Zeiss Canada Inc. | M-152 | Instruments |
| Magnetic Holding Device for micromanipulator | World Precision Instruments | M1 | Instruments |
| Steel Base Plate for micromanipulator | World Precision Instruments | 5052 | Instruments |
| Micropipette Holder | World Precision Instruments | MPH3 | Instruments |
| Micropipette Handle | World Precision Instruments | 5444 | Instruments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | Instruments |
| Vaporizer for isoflurane anesthetic | Porter Instruments Company | MODEL 100-F | Instruments |
| Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools | Metrex Research Corporation | 10-8100 | Surgical Reagents |
| Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing | Sigma Aldrich | G1264 | Surgical Reagents |
| Germex for sterilizing surgical tools | Vétoquinol | DIN# 00141569 | Surgical Reagents |
| BNP ophthalmic ointment | Vétoquinol | DIN# 00516414 | Surgical Reagents |
| Nair® | Distributed by Church & Dwight Co., Inc. | commercially available | Surgical Reagents |
| Stanhexidine 4% w/v skin cleaner | Omega Laboratories Inc. | 01938983 | Surgical Reagents |
| Buprenorphine (Temgesic) analgesic | Schering-Plough | 531-535 | Surgical Reagents |
| Sulpha “25” sulphamethazine oral antibiotic | Professional Veterinary Laboratories | DIN# 00308218 | Surgical Reagents |
| Lactated Ringer Solution | Baxter Corporation | DIN# 0061085 | Surgical Reagents |
| Saline – 0.9% sodium chloride | B-Braun Medical Inc. | DIN# 01924303 | Surgical Reagents |
| Inhalation Anesthetic – Isoflurane USP | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | DIN# 02237518 | Surgical Reagents |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Surgical Reagents |
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