Summary
在这里，我们描述了一套与酵母顺序寿命模型来研究基因/通路调节，或在衰老过程中作出贡献基因组DNA不稳定，可结合DNA突变检测。
Abstract
使用酿酒酵母衰老模型的研究已发现的寿命是部分在高等真核生物 1-2中保守的调控途径。酵母衰老模型的简单性和力量，也可以探讨研究DNA损伤和基因组维修以及他们的贡献，在衰老过程中的疾病。在这里，我们描述了一个系统来研究年龄相关的DNA突变，包括碱基置换，移码突变，染色体重排总值，并同源/ homeologous重组，以及通过简单的DNA相结合的酵母顺序寿命核DNA修复活性损伤和突变检测。这里所描述的方法应便于识别基因/途径调节基因组的不稳定和机制的基础在哺乳动物中年龄依赖性的DNA突变与癌症。
Protocol
两个寿命模型被用来研究在 S老化酵母 ：RLS和CLS。复制（萌芽）寿命（RLS）的基础上观察，酵母母细胞进行有限数量的3-6部门。我们将重点讨论的时间寿命（CLS），模型的基础上，文化或板7-11非分裂酵母的时间生存。野生型酵母生长指数为10-12小时，在合成葡萄糖完成（SDC）中型。当血糖水平降低，酵母发酵呼吸的开关，这个过程称为diauxic转变。细胞继续分裂期间慢慢进入G 0逮捕前约48小时后diauxic阶段。细胞的代谢率仍然高至5-6天（0天接种日）。随着时间的推移细胞的生存能力可以访问按时间顺序老化细胞的百分比抽样，每两天，可以退出 G 0逮捕和形式丰富YPED板殖民地。
1。酵母顺序寿命（CLS）的液体培养
- 单个菌落接种到1毫升合成完整的葡萄糖培养基（SDC，表1）孵育过夜振荡（220转）30 ° C。三个独立的殖民地接种应提供生物副本的每个应变准备。
- 食入SDC的介质（通常为10毫升）稀释过夜培养外径= 0.05-0.1（〜1:100稀释）和孵化用颤抖的（220转）30 ° C。这个时间点被认为是0天的时间老化。保持一个文化/烧瓶的体积（10毫升50毫升的文化，或长/大实验在125毫升25毫升文化）1:5的比例，以确保适当的曝气。
- 从第3天开始，取出10μL从烧瓶等分，YEPD培养基高压灭菌的水，10μL稀释的文化（即10月4 -10）（1％酵母提取物，细菌用胰蛋白胨2％，2％葡萄糖稀释10000倍2％琼脂）板，并在30℃孵育48-72小时前殖民地形成团结（CFU）的计算。
- 3天CFU被认为是100％生存。老化在随后的日子里文化的稀释因素，应作相应调整，以确保〜20-100的CFU检测菌落（例如，10月4 -10，10月4 -30 10 3 -10等）。对于野生型细胞，在DBY746背景的华彩达到1％，生存11天左右。
在原位的可行性实验的变化包括：
- 热量限制（CR）葡萄糖限制。稀释葡萄糖有限的SC培养基培养过夜（如0.5或0.05％，而不是标准的2％葡萄糖），一般会导致低人口密度在第3天的饱和度，但很多扩展的平均值和最大值（10％ 的生存）的寿命12。
- 极端CR /饥饿，灭菌水冲洗3天的固定相的文化（通常10毫升，如在上述第3步，）（悬浮细胞，在同等体积的水和自旋向下在2500转5分钟，重复3次）。 Incubationof细胞在水中模仿饥饿的条件下，酵母可能会遇到在野外。每两天后，老龄化的文化应与灭菌水清洗，并在同等体积的水悬浮删除裂解死细胞释放任何营养素。执行采样老化文化如上所述的可行性实验。这种饥饿状况将导致几乎DBY746在野生型菌株12平均华彩翻番。
在原位的可行性实验2。
在液体培养基中，存活细胞的一小部分可能会重新进入细胞周期和成长，利用剩下的营养素或这些发布的形式溶解在介质中的死细胞， 称为表型再生/喘气13。我们开发了一个可行性上一个直接制版系统，利用DBY746应变（TRP1）的营养缺陷型来规避再生/喘气问题，也让不断曝光，剥夺或外部的各种营养素或酵母刺激的效果测试CLS 11。 在原位可行性实验，这也模仿复制寿命模型，细胞不断暴露寿命分析的时间，以丰富的营养物质。
- 单个菌落接种到1毫升合成完整的葡萄糖培养基（SDC）和孵育过夜振荡（220转）30 ° C。至少有三个独立的殖民地接种应提供生物副本每个应变准备。
- 让文化成长〜10 8细胞/ ml（外径600 =〜10），淡化水culturewith蒸压100-200 cell/10μL（通常是10 的 4倍稀释）和1000 cells/10μL（10 3倍稀释）。
- 板块上一个色氨酸辍学SDC板10-30μl稀释文化的两个等分。对于ř每一株，准备8日至20板的设置，根据电镀密度和标记（例如，10的4倍稀释，板10μL或10 4 -10 10 -30 10 3 -10 10 3 -30等），确保10-100殖民地可以算在预期下降的可行性，在衰老过程中。
- 孵育寿命分析的时间设置在30 ° C板。
- 电镀一天，每2天随后，取出一板和明智的下拉添加色氨酸（2毫克/毫升）0.5毫升，让可行的细胞生长。额外的48-72小时，在30 ° C孵育板。统计色氨酸除了一天的可行性CFU。电镀一天的CFU被认为是100％的存活率。
在原位的可行性实验的变化包括：
- 平板时代的细胞（极端饥饿状态）。加入1 ml 2X YPED色氨酸，而不是在随后的日子里，让经济增长和CFU 计数 14 。
- 色氨酸辍学合成完全培养基不同碳源，如各种浓度的葡萄糖（葡萄糖限制热量的限制），各种碳源，如乙醇，甘油，醋酸14板的年龄细胞。加入1毫升的葡萄糖/色氨酸溶液（20％葡萄糖和1mg/ml的色氨酸），让经济增长和CFU计数。
- 其他营养物质的操纵，如氮。
3。在按时间顺序衰老的DNA损伤和突变频率
刀豆电阻（CAN R）和CAN1测序
自发突变频率可以通过测量刀豆电阻（CAN R）按时间顺序老化文化频率进行评估。 CAN1（YEL063）基因，它编码的血浆精氨酸通透，的突变使细胞抵抗的模拟L - canavanine.Can精氨酸ř在不同时间点收集的殖民地，也可用于基因组DNA 的提取和随后的CAN1测序保存基因，它可以提供突变谱数据（突变测量师，SoftGenetics）。
碱基（TRP +回归）
TRP1 - 289菌株在TRP1编码序列中包含一个琥珀突变（C403T） 。测量频率色氨酸+回归15 TRP1 - 289允许在酵母顺序老化中的碱基替换率的估计。
移码突变
赖氨酸-应变EH150（ 马塔，lys2ΔBglII，TRP1 -Δ，HIS3 -Δ200，URA3 - 52，ADE2 - 1O）港口通过插入4个核苷酸，以创建一个经 Bgl II限制在 LYS2基因的酶切位点，构建一个lys2ΔBglII突变。由此产生的4转向开放阅读赖氨酸营养缺陷型的框架，可以通过小的插入/ 缺失突变16-17逆转结果。
总值的染色体重排（GCRs）
为了检测染色体重排总值（GCRs），我们产生了突变株，其中HXT13（YEL069），编码一个高度冗余的己糖转运，是一个 URA3 卡带 18中断。HXT13位于第五号染色体上的基因突变是7.5 kb的端粒， 以 CAN1两个CAN1和URA3基因使细胞的耐药性分别为L -刀豆和5 -氟酸（5FOA），。考虑到，在这两个基因， 可以 5FOA ř频率分析发生点突变频率低，提供了一个估算的GCRs结果，在这两个基因的损失。
同源和homeologous重组
要监视的同源水平（100％），在时间顺序老化homeologous重组（91％），我们产生了突变体的线性质粒（HIS3：内含子IR - URA3）携带“100％同源反向重复序列（IRS）（ pSR406 ）或homeologous IRS HIS3轨迹19（pSR407）的91％ 。国税局之间的重组，允许功能HIS3蛋白的表达。
- 在正常的可行性实验（如上所述）的同时，取出一个细胞老化文化适量，
- 可以突变，开始〜2 × 10 7细胞（200μL）3天文化;
- 色氨酸+回归，开始〜10 8个细胞（500-1000微升3天的文化）;
- 赖氨酸+帧移码突变，启动〜10 8个细胞（500-1000第3天文化液） ;
- GCRs，开始2 - 3x10 8细胞（2-3毫升3天的文化）;
- 同源和homeologous重组，启动及波浪线5X10 7细胞（200-500微升3天的文化）;
- 颗粒与台式离心机（6000转）5分钟的细胞。
- 再次重悬在1毫升蒸压水，和颗粒细胞的细胞。
- 悬浮细胞沉淀在100μL水。板细胞，
- ř突变，精氨酸辍学合成完整的中小板，（SDC -精氨酸，辅以60微克/毫升硫酸L -刀豆）;
- 色氨酸+回归，色氨酸辍学板（SDC -色氨酸）;
- 赖氨酸+帧移码突变，赖氨酸辍学板（SDC -赖氨酸）;
- 为GCRs，精氨酸辍学板（SDC -精氨酸）辅以5FOA（1毫克/毫升）和L -刀豆硫酸（60微克/毫升）;
- 同源和homeologous重组，补充组氨酸辍学板，半乳糖（2％）。
- 计数CFUs 3-4天的潜伏期后，30 ° C。突变频率是正常化的活菌数。
补充到原位的可行性实验，年龄依赖性色氨酸+回归，赖氨酸+移码突变，重组，或者可以ř也可以在铭牌上老化细胞研究。
- 板细胞（〜10 8细胞/板），色氨酸，赖氨酸，他辍学，或L -刀豆氨酸的合成完整的中板（如上所述）。
- 每两天（或感兴趣的时间点），得分新兴的殖民地。
- 突变频率估计正常化新兴殖民地特定的一天活菌总数。
4。 Translesion合成性（TLS）
年龄依赖性的突变频率的增加可能涉及增加大分子的损伤，减少细胞保护/修复，并增加在衰老过程中的DNA修复错误（如Polζ依赖translesion合成，TLS）。例如，长寿命的sch9Δ突变体表现出SOD2升高表达，表达下降的容易出错的DNA修复酶 REV1 20 。在这里，我们描述了一个实验，受损的DNA模板和整个核提取物相结合 ，以评估在体外的TLS。
- 准备核提取物Wang 等人所述的 21个;量化BCA法测定（皮尔斯）的蛋白浓度。
- 0，5，10或20微克至50μL（终体积）反应，包含TLS的缓冲液（20毫米HEPES，MgCl 2的7毫米，1毫米的数码地面电视，25毫米氯化钠，pH值7.8），200μMdNTPs和100 nm的核提取物5' - 32 P标记的12 - mer引物（5' - CGA TGG TAC GGA - 3'）退火48 - MER模板包含利益的损害DNA（5' - TCG的ATA CTG的多伦多注册税务师ATG的AT＆T的AAC GAC中TXA AGC ACG TCC GTA CCA TCG的3'，其中X是损坏的部位，例如，8 - 氧代- G碱基网站，等）。
- 孵育的混合物，在30 ° C为30分钟，增加2.5μLEDTA（20毫米）和2μL蛋白酶K（10毫克/毫升）终止反应。
- 苯酚抽提和乙醇沉淀分离纯化的DNA。
- 悬浮在凝胶样缓冲液50μL的DNA（20毫米EDTA，98％甲酰胺和染料）。
- 解决19％聚丙烯酰胺凝胶translesion的合成产品。
- 量化的TLS使用磷光（ 图1）。
5。代表性的成果
我们通常使用为100％的标准液体华彩分析生存3天的CFU计数。生存，可以安装在随后几天的百分比计算的平均值（50％的生存）和最高（10％ 的生存）寿命12。寿命从原位可行性检测得到的结果通常是一致的，但与那些使用液体华彩检测与减少的平均寿命，这是由于部分细胞不断暴露营养素。葡萄糖存在抑制保护细胞的活性，减少应激反应转录因子，如MSN2 / 4和Gis1 12的反式显示。
年龄相关的基因突变频率很大程度上取决于应变的背景下，遗传操纵，文化条件和年龄而异。表2显示了在野生型菌株（DBY746）获得的典型结果。
| 组件 | g / L的 |
|---|---|
| D -葡萄糖 | 20 |
| 硫酸铵 | 5 |
| 氮基（-AS/-AA） | 1.8 |
| 磷酸二氢钠 | 1.4 |
| 毫克/升 | |
| 腺嘌呤 | 80 |
| L -精氨酸 | 40 |
| L -天冬氨酸 | 100 |
| L -谷氨酸 | 100 |
| L -组氨酸 | 80 |
| L -异亮氨酸 | 60 |
| L -亮氨酸 | 120 |
| L -赖氨酸 | 60 |
| L -蛋氨酸 | 80 |
| L -苯丙氨酸 | 60 |
| L -丝氨酸 | 400 |
| L -苏氨酸 | 200 |
| L -色氨酸 | 80 |
| L -酪氨酸 | 40 |
| L -缬氨酸 | 150 |
| 尿嘧啶 | 80 |
表1合成完整的葡萄糖培养基，SDC（用NaOH调整pH至6.0） 。超过4倍，组氨酸，亮氨酸，色氨酸和尿嘧啶包括以弥补营养缺陷型的DBY746毒株。
| 第3天（平均± SEM） | （在衰老过程中） | |
|---|---|---|
| 可以ř | 1.76 ± 0.12 × 10 -6 | 6-8 X10 -6 |
| 色氨酸+的回归 | 6.60 ± 1.70 × 10 -8 | 1.60 × 10 -6 |
| 赖氨酸+帧移码突变 | 3.00 ± 0.78 × 10 -8 | 0.70 × 10 -6 |
| GCRs | 0.62 ± 0.10 × 10 -8 | 0.30 X10 -6 |
| 同源重组 | 5.55 ± 2.74 × 10 -6 | 27.00 X10 -6 |
| Homeologous重组 | 0.12 ± 0.04 × 10 -6 | 0.48 × 10 -6 |
表2。典型的野生型细胞的突变频率，在时间顺序老化（DBY746 ）。
图1。translesion合成（TLS）20的结果。从3日龄固定相（DBY746）野生型和sch9Δ突变的细胞的核提取物与未受损害或碱基的网站，其中包含30分钟的DNA模板，在30 ° C孵育TLS产品是由固体（完好的模板）或点（损坏的模板）线。有没有translesion sch9Δ突变体合成核提取物中观察到。免费引物的开箭头表示。
Discussion
液体老化文化的某个时候表现出的再生/喘气表型的13，其中的华彩分析的复杂性。愈合，通常会出现超过90-99％的人口已经失去了可行性。这种表型往往与增加氧化应激和/或降低保护细胞。例如，这种表型的频率超过在缺乏胞质超氧化物歧化酶的细胞双打，并大大降低了在长寿的突变体 （例如，sch9Δ或ras2Δ）或22突变体的过度表达超氧化物歧化酶。在实践中，我们定义为增加可行性或稳定在3连续采样在时间顺序老化，死亡率高阶段的可行性再生。
年龄相关的不同的DNA突变频率差异很大，取决于应变的背景下，遗传操纵，文化条件，以及再生/喘气和极低的生存。应进行预实验，在时间点，如与突变检测的各种电镀密度平均和最大的生存前performingthe满刻度的寿命分析，以确定突变频率范围。野生型菌株应始终包含在一个寿命或突变频率的研究，平行任何治疗或基因突变等实验间的变化可占。多种生物副本应包括在研究，液体和在应进行原位可行性/突变分析证实的结果。
而是把重点放在一个特定类型的DNA突变分析，组合使用多种检测年龄相关的基因组不稳定，可能揭示出特定的DNA损伤和DNA损伤修复系统（S），年龄相关的基因组不稳定。例如，在毛的染色体重排（GCRs）显著增加，比其他DNA突变的，是观察野生型酵母提示elevationof双链断裂和/或减值的非同源末端加入酵母期间（NHEJ）按时间老化（见表2）。 CAN1突变谱（CAN1的基因测序）在野生型老化酵母建议时间老化和容易出错的DNA修复过程中的增加，而在长寿命sch9Δ突变体，少氧化DNA损伤和氧化损伤大大减少错误容易发生translesion合成观察20。
此处描述的方法可以进一步支出来研究年龄相关的基因组不稳定。例如，静态和非静态的细胞可以分离出酵母固定相使用密度梯度法Allen 等人所描述的文化23。这里所描述的基因突变检测相结合，我们曾报道，一大截的年龄相关的基因突变，从静态的细胞，而不是分割，损坏或细胞凋亡20,24，出现。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢提供质粒和酵母S. Jinks罗伯逊和E Heidenreich; P. Pham和中频古德曼帮助了与TLS的检测。这项工作是支持中的一部分，美国联邦和衰老研究补助金由NIH AG20642，AG025135。
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