Summary
Aquí se describe un conjunto de ensayos de mutación del ADN que se pueden combinar con el modelo cronológico levadura vida a estudiar los genes / vías que regulan o contribuir a la inestabilidad del ADN genómico durante el envejecimiento.
Abstract
Los estudios que utilizan el modelo de Saccharomyces cerevisiae envejecimiento han descubierto vías vida útil reguladoras que están parcialmente conservadas en eucariotas superiores 1-2. La simplicidad y el poder del modelo de levadura de envejecimiento también se pueden explorar para estudiar el daño del ADN y el mantenimiento del genoma, así como sus contribuciones a las enfermedades durante el envejecimiento. Aquí se describe un sistema para estudiar la edad que dependen de mutaciones en el ADN, incluyendo la sustitución de la base, las mutaciones de cambio de marco, bruto reordenamientos cromosómicos, y homólogas / recombinación homeologous, así como la actividad de reparación del ADN nuclear mediante la combinación de la levadura de esperanza de vida cronológica con el ADN sencillo daños y los ensayos de mutación. Los métodos descritos aquí deben facilitar la identificación de genes / vías que regulan la inestabilidad genómica y los mecanismos que subyacen dependiente de la edad mutaciones en el ADN y el cáncer en mamíferos.
Protocol
Dos modelos de vida que se utiliza para estudiar el envejecimiento en el S. cerevisiae: SPI y CLS. La replicación (en ciernes) vida (SPI) se basa en la observación de que las células de levadura madre pasan por un número finito de divisiones 3-6. Nos centraremos en el orden cronológico de la vida útil (CLS), un modelo basado en la supervivencia cronológico de la no división de la levadura en la cultura o en placas de 7.11. Levadura de tipo silvestre que crece de forma exponencial durante 10-12 horas en la síntesis completa de dextrosa (SDC) medio . Cuando el nivel de glucosa disminuye, los interruptores de la levadura de la fermentación de la respiración, un proceso denominado diauxic cambio. Las células continúan dividiéndose lentamente durante la fase de post-diáuxico durante aproximadamente 48 horas antes de entrar en G 0 arresto. La tasa metabólica de las células se mantiene alta hasta el día 06/05 (día 0 es el día de la inoculación). La viabilidad celular a través del tiempo se puede acceder por el porcentaje de las células del envejecimiento cronológico, muestras cada dos días, lo que puede salir de G 0 arresto y la formación de colonias de ricos platos YPED.
1. Levadura cronológico vida útil (CLS) en cultivo líquido
- Inocular una colonia en 1 ml de síntesis de glucosa en medio completo (SDC, Tabla 1) e incubar durante la noche con agitación (220 rpm) a 30 ° C. Tres inóculos de colonias independientes deben estar preparados para cada cepa para ofrecer réplicas biológicas.
- Diluir el cultivo de una noche fresca en medio de la COSUDE (normalmente 10 ml) a OD = 0.05-0.1 (~ dilución 1:100) y se incuba con agitación (220 rpm) a 30 ° C. Este punto de tiempo se considera el día 0 del envejecimiento cronológico. Mantener una relación 1:5 de volumen de cultivo / frasco (10 ml de cultivo en 50 ml, o para los experimentos más largo / grande 25 ml de cultivo en 125 ml) para asegurar la ventilación adecuada.
- A partir del día 3, eliminar dos alícuotas de 10 l de la mufla, diluir 10.000 veces en agua esterilizada, 10 de cultivo diluido l (es decir, 10 4 -10) en YEPD (1% extracto de levadura, 2% Bacto peptona, 2% de dextrosa , 2% de agar) placas e incubar a 30 ° C durante 48-72 horas antes de la formación de colonias se unen (UFC) se cuenta.
- Día 3 UFC se considera 100% de supervivencia. Factores de dilución de la cultura del envejecimiento en los días subsiguientes se debe ajustar en consecuencia para garantizar ~ 20-100 colonias en el ensayo de UFC (por ejemplo, 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, etc.) De células de tipo salvaje en el fondo DBY746, el CLS alcanza el 1% de supervivencia alrededor del día 11.
Las variaciones de ensayo de la viabilidad in situ incluyen:
- La restricción calórica (CR) por la limitación de la glucosa. Dilución de la cultura durante la noche en medio de la glucosa limitada SC (por ejemplo, 0,5 o 0,05% en lugar del estándar de glucosa 2%) por lo general conducen a una menor densidad de saturación de población en el día 3, pero mucho más extendida la media y la máxima (10% de supervivencia) esperanza de vida 12.
- De extrema CR / hambre, lavar el día 3 la cultura fase estacionaria (generalmente 10 ml, como en el paso 3) con agua esterilizada (suspender las células en un volumen igual de agua y centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos, repetir 3 veces). Incubationof células en el agua imita la condición de hambre que la levadura puede encontrar en la naturaleza. Cada dos días después, la cultura del envejecimiento se debe lavar con agua esterilizada y se resuspende en un volumen igual de agua para eliminar los nutrientes liberados de lisadas las células muertas. Realizar ensayo de viabilidad mediante el muestreo de la cultura del envejecimiento como se describió anteriormente. Esta condición de hambre se llevó a casi el doble de la media de CLS en el tipo salvaje DBY746 cepa 12.
2. En el ensayo de viabilidad in situ
En el cultivo líquido, una pequeña fracción de las células sobrevivientes pueden volver a entrar en el ciclo celular y crecer utilizando los nutrientes restantes o los formulario publicado lisadas las células muertas en el medio, un fenotipo denominado recrecimiento / jadeando 13. Hemos desarrollado un sistema de viabilidad-en-un-plato que utiliza el auxotrofía de la cepa DBY746 (trp1) para evitar el rebrote / jadeando problema y permitir que las pruebas de los efectos de la exposición permanente o la privación de diversos nutrientes externos o los estímulos de la levadura CLS 11. Este ensayo de viabilidad in situ también imita el modelo de replicación vida de tal manera que las células están constantemente expuestos a abundantes nutrientes para la duración del análisis de ciclo de vida.
- Inocular una colonia en 1 ml de síntesis de glucosa en medio completo (COSUDE) e incubar durante la noche con agitación (220 rpm) a 30 ° C. Al menos tres inóculos de colonias independientes deben estar preparados para cada cepa para ofrecer réplicas biológicas.
- Deje que la cultura crezca a aproximadamente 10 8 células / ml (OD 600 = ~ 10), diluir el agua culturewith autoclave a 100-200 cell/10 l (generalmente 10 4 veces dilución) y 1.000 células/10 l (10 3 dilución doble).
- Placa de dos alícuotas de 10 a 30 l de cultivo diluido en una sola plancha de deserción triptófano COSUDE. Parar cada cepa, preparar una serie de 8 a 20 placas y etiquetados de acuerdo a la densidad de la galvanización (por ejemplo, 10 4 veces diluida, placa 10 l ó 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, 10 3 -30 , etc), que garantiza 10-100 colonias se pueden contar en previsión de disminución de la viabilidad durante el envejecimiento.
- Se incuba la placa regulado a 30 ° C durante la duración del análisis de ciclo de vida.
- En el día de la siembra y posteriormente cada 2 días, retire una placa y sabio abandono añadir 0,5 ml de triptófano (2 mg / ml) para permitir que las células viables para crecer. Incubar la placa a 30 ° C durante 48-72 horas adicionales. Contar con la UFC para la viabilidad en el día de la adición de triptófano. El UFC en el día de la siembra se considera 100% de supervivencia.
Las variaciones de ensayo de la viabilidad in situ incluyen:
- Las células de edad en placas de agar (una condición de hambre extrema). Añadir 1 ml de 2x YPED lugar de triptófano en los días siguientes para permitir el crecimiento y el recuento de UFC 14.
- Las células en las placas de edad con el abandono de triptófano sintéticos medio completo con diversas fuentes de carbono, por ejemplo, varias concentraciones de glucosa (la restricción de calorías por la limitación de la glucosa), diversas fuentes de carbono como el etanol, glicerol, ácido acético 14. Añadir 1 ml de glucosa / solución de triptófano (20% de glucosa y el triptófano 1mg/ml) para permitir el crecimiento y el recuento de UFC.
- La manipulación de otros nutrientes, como nitrógeno.
3. Daños en el ADN y la frecuencia de mutaciones durante el envejecimiento cronológico
Canavanina resistencia (puede r) y la secuenciación can1
Frecuencia de mutación espontánea puede ser evaluado mediante la medición de la frecuencia de resistencia a la canavanina (Can r) en cultivos cronológicamente envejecimiento. Las mutaciones en el CAN1 (YEL063) gen, que codifica la plasma arginina permeasa, hacer que las células resistentes a la arginina análogo de L-canavanine.Can colonias r recogidas en diferentes puntos de tiempo también se pueden guardar para la extracción de ADN genómico y posterior secuenciación de la CAN1 gen, que puede proporcionar los datos de la mutación del espectro (con mutación Surveyor, SoftGenetics).
Sustituciones de bases (Trp + reversiones)
Las cepas con trp1-289 contiene una mutación ámbar (C403T) en la secuencia de codificación trp1. Medición de la frecuencia de trp1-289 a la reversión Trp + 15 permite la estimación de la tasa base de la sustitución de la levadura durante el envejecimiento cronológico.
Cambio del marco de las mutaciones
La Lys - cepa EH150 (Mata, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200, ura3-52, ade2-1o) alberga una mutación lys2ΔBgl II que se construyó mediante la inserción de 4 nucleótidos para crear una restricción Bgl II sitio de la enzima en el gen LYS2 . El resultado de cuatro cambios en los resultados del marco de lectura abierta en auxotrofía de la lisina que puede ser revertido por la pequeña inserción / deleción mutaciones 16-17.
Bruto reordenamientos cromosómicos (GCR)
Para detectar reordenamientos cromosómicos bruto (GCR), que genera una cepa mutante, en el que HXT13 (YEL069), que codifica un transportador de hexosas altamente redundante, fue interrumpido por un cassette URA3 18. HXT13 se encuentra a 7,5 kb telomérica CAN1 mutaciones en el cromosoma V. en tanto CAN1 y URA3 genes hacen resistencia de las células de L-canavanina y 5-fluoroorotic ácido (5FOA), respectivamente. Teniendo en cuenta la baja frecuencia de mutaciones puntuales que se producen en los genes, el análisis de Can r r 5FOA frecuencia proporciona una estimación de los GCR que resultan en la pérdida de ambos genes.
Recombinación homóloga y homeologous
Para controlar el nivel de homólogos (100%) y la recombinación homeologous (91%) durante el envejecimiento cronológico, hemos generado mutantes en los que linearized plásmidos (HIS3:: intrón-IR-URA3) la realización de cualquiera de 100% repite homóloga invertida (IR) (pSR406 ) o el 91% homeologous IRS (pSR407) en el locus HIS3 19. La recombinación entre el IRS permite la expresión de la proteína funcional His3.
- En paralelo al ensayo de viabilidad normal (como se describió anteriormente), retirar una cantidad adecuada de células de la cultura del envejecimiento,
- Puede mutación de r, comenzar con ~ 2x10 7 células (200 l de 3 días de cultivo);
- para la reversión Trp +, comenzar con ~ 10 8 células (500-1000 l de 3 días de cultivo);
- de Lys + marco de cambio mutación, empieza con ~ 10 8 células (500-1000 l de 3 días de cultivo);
- para GCR, empezar con 2-3x10 8 células (2-3 ml de 3 días de cultivo);
- para la recombinación homóloga y homeologous, y comenzar con tilde; 5x10 7 células (200-500 l de 3 días de cultivo);
- Que sedimenten las células con el banco-superior de la máquina centrífuga (6000 rpm durante 5 min).
- Resuspender las células en 1 ml de agua en autoclave, y que sedimenten las células de nuevo.
- Resuspender el sedimento celular en 100 l de agua. Células de la placa,
- Puede mutación de r, en síntesis deserción arginina-placas de medio completo (SDC-Arg, complementada con 60 mg / ml de L-canavanina sulfato);
- para la reversión Trp +, en las placas de deserción escolar-triptófano (SDC-Trp);
- de Lys + marco de cambio mutación, en las placas de lisina de deserción (SDC-Lys);
- para GCR, en las placas de deserción escolar-arginina (SDC-Arg), complementado con 5FOA (1 mg / ml) y la L-canavanina sulfato (60 mg / ml);
- para la recombinación homóloga y homeologous, en las placas de deserción histidina-complementado con la galactosa (2%).
- Contar las UFC después de la incubación de 3-4 días 'a 30 ° C. La frecuencia de mutación se normaliza en el número de células viables.
Complementaria a la de ensayo de viabilidad in situ, dependiente de la edad reversión Trp +, + Lys marco de cambio mutación, la recombinación, o puede r también se puede estudiar en las células de edad en el plato.
- Células de la placa (~ 10 8 células / placa) a Trp, Lys-, su abandono, o la L-canavanina placas sintéticas medio completo (como se describió anteriormente).
- Cada dos días (o en el punto de tiempo de interés), la puntuación de las colonias de reciente aparición.
- La frecuencia de mutación se calcula mediante la normalización de las colonias de reciente aparición en el número total de células viables del día específico.
4. Translesión síntesis (TLS)
El aumento de la mutación de edad dependientes de la frecuencia puede ser un daño mayor macromolécula, la protección del menor celular / reparación, y el aumento de la reparación del ADN erróneas (como Polζ dependiente de la síntesis de translesión, TLS) durante el envejecimiento. Por ejemplo, la larga vida Sch9 Δ mutantes exhiben una elevada expresión de SOD2, y disminución de la expresión de la enzima propenso a errores de reparación del ADN Rev1 20. A continuación se describe un ensayo de combinación de plantilla de ADN dañado y extracto nuclear conjunto para evaluar el TLS in vitro.
- Preparar el extracto nuclear según lo descrito por Wang et al 21;. Cuantificar la concentración de proteínas de ensayo BCA (Pierce).
- Añadir g 0, 5, 10 ó 20 de extractos nucleares de 50 l (volumen final), las reacciones que contiene TLS Buffer (20 mM HEPES, 7 mM de MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 7,8), μMdNTPs 200 y 100 nm 5'-32P 12-mer primer (5'-CGA GGA TGG TAC-3 ') recocido a una plantilla de 48-mer que contiene daños en el ADN de interés (5'-CTG TCG ATA GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC ACG TCC GTA CCA TCG-3 ', en la que X es el lugar del daño, por ejemplo, el sitio abasic, 8-oxo-G, etc.)
- Incubar la mezcla a 30 ° C durante 30 minutos, terminar la reacción con la adición de 2,5 l de EDTA (20 mM) y 2 l de proteinasa K (10 mg / ml).
- Purificar el ADN con la extracción con fenol y precipitación con etanol.
- Resuspender el ADN en 50 l de tampón de carga de gel (98% formamida, 20 mM EDTA, y el tinte).
- Resolver los productos de síntesis translesión en geles de poliacrilamida 19%.
- Cuantificar el uso de TLS phosphorimaging (Figura 1).
5. Resultados representante
Por lo general utilizan el recuento de UFC en el día 3 como la supervivencia del 100 por ciento en el análisis estándar CLS líquido. El porcentaje de supervivencia en los días posteriores pueden ser equipados para el cálculo de la media (50% de supervivencia) y máximo (10% de supervivencia) la vida se extiende por 12. La vida útil de los resultados obtenidos en ensayo de viabilidad in situ son generalmente consistentes con aquellos que utilizan el ensayo CLS líquido, pero con una reducción de la esperanza de vida media, que se debe en parte al hecho de que las células están constantemente expuestos a los nutrientes. Presencia de glucosa inhibe la actividad de protección celular como se muestra en la transactivación reducción del factor de transcripción de respuesta al estrés, tales como MSN2 / 4 y 12 Gis1.
Dependiente de la edad la frecuencia de mutación varía mucho dependiendo de la cepa de antecedentes, la manipulación genética, las condiciones de cultivo, y la edad. La Tabla 2 muestra los resultados generales obtenidos en la cepa de tipo salvaje (DBY746).
| Componente | g / L |
|---|---|
| D-glucosa | 20 |
| De sulfato de amonio | 5 |
| Base de nitrógeno (-AS/-AA) | 1.8 |
| NaH2PO4 | 1.4 |
| mg / L | |
| Adenina | 80 |
| L-Arginina | 40 |
| Ácido L-aspártico | 100 |
| L-ácido glutámico | 100 |
| L-histidina | 80 |
| L-isoleucina | 60 |
| L-leucina | 120 |
| L-lisina | 60 |
| L-Metionina | 80 |
| L-fenilalanina | 60 |
| L-serina | 400 |
| L-Treonina | 200 |
| L-triptófano | 80 |
| L-tirosina | 40 |
| L-valina | 150 |
| Uracilo | 80 |
Tabla 1. Medio sintético de glucosa completo, la COSUDE (ajustar a pH 6,0 con NaOH). Cuatro veces el exceso de histidina, leucina, triptofano y uracilo se incluyen para compensar la auxotrofía de la cepa DBY746.
| Día 3 (media ± SEM) | Hasta (durante el envejecimiento) | |
|---|---|---|
| Puede r | 1,76 ± 0,12 x10 -6 | 6.8 x 10 -6 |
| Trp + reversión | 6,60 ± 1,70 x10 -8 | 1,60 x10 -6 |
| Lys + marco de cambio mutación | 3,00 ± 0,78 x10 -8 | 0,70 x10 -6 |
| GCR | 0,62 ± 0,10 x10 -8 | 0,30 x10 -6 |
| La recombinación homóloga | 5,55 ± 2,74 x10 -6 | 27,00 x10 -6 |
| Recombinación homeologous | 0,12 ± 0,04 x10 -6 | 0,48 x10 -6 |
Tabla 2. Frecuencias típicas de mutación de células de tipo salvaje (DBY746) durante el envejecimiento cronológico.
Figura 1. Resultados de la síntesis de translesión (TLS) 20. Extractos nucleares a partir de 3 días de edad, la fase estacionaria de tipo salvaje (DBY746) y Sch9 Δ células mutantes se incubaron con las plantillas de ADN en buen estado o abasic que contiene el sitio durante 30 minutos a 30 ° C. TLS productos están indicados por un sólido (con la plantilla en buen estado) o de puntos (con una plantilla dañada) líneas. No había observado en la síntesis de translesión extracto nuclear de Sch9 mutantes Δ. Primers libre se indica la flecha abierta.
Discussion
Líquido culturas envejecimiento en algún momento presentan el nuevo crecimiento / fenotipo jadeando 13, lo que complica el análisis CLS. Nuevo crecimiento se produce normalmente cuando más de 90-99% de la población ha perdido su viabilidad. Este fenotipo se asocia a menudo con aumento del estrés oxidativo y / o disminución de la protección de la célula. Por ejemplo, la frecuencia de este fenotipo es más del doble en las células que carecen de la superóxido dismutasa citosólica y reduce en gran medida en el de larga duración mutantes (por ejemplo, Sch9 Δ Δ o RAS2) o mutantes que sobreexpresan superóxido dismutasas 22. En la práctica, se define el nuevo crecimiento como un aumento de la viabilidad o la estabilización de la viabilidad de tres muestreos consecutivos en la fase de alta mortalidad durante el envejecimiento cronológico.
Dependiente de la edad la frecuencia de las mutaciones del ADN varían mucho dependiendo de la cepa de antecedentes, la manipulación genética, las condiciones de cultivo, así como la regeneración jadeando / y la supervivencia muy baja. Pre-experimentos deben llevarse a cabo en momentos tales como la supervivencia media y la máxima densidad de la galvanización de varios ensayos de mutación para determinar el rango de frecuencia de mutación antes de su análisis a gran escala performingthe vida. La cepa de tipo salvaje siempre se debe incluir en un período de vida o estudio de la frecuencia de mutación en paralelo a cualquier tratamiento o mutantes genéticos, de tal manera que entre experimentar variaciones pueden ser explicadas. Múltiples réplicas biológicos deben ser incluidos en el estudio, y, tanto líquidos como in situ la viabilidad / mutación de los ensayos deben realizarse para corroborar los resultados.
En lugar de centrarse en un tipo específico de mutación del ADN, el perfil de la inestabilidad genómica dependiente de la edad mediante ensayos múltiples en combinación, pueden arrojar luz sobre el daño del ADN específica y daños en el ADN de reparación del sistema (s) que contribuyen a la inestabilidad genómica dependiente de la edad. Por ejemplo, un aumento significativo en bruto reordenamientos cromosómicos (GCR), en comparación con los de otras mutaciones en el ADN, se observa en la levadura de tipo salvaje que sugiere una ruptura elevationof doble cadena y / o deterioro de una de extremos no homólogos de unión (NHEJ) en la levadura envejecimiento cronológico (Tabla 2). El espectro de mutación can1 (secuenciación del gen CAN1) obtenidos en el envejecimiento de la levadura de tipo salvaje sugiere un incremento en el daño oxidativo durante el envejecimiento cronológico y propenso a errores de reparación del ADN, mientras que, en la larga vida Sch9 mutantes Δ, daños en el ADN menos oxidativo y propenso a errores muy reducida síntesis translesión se observaron 20.
Los métodos descritos aquí pueden ser aún más gastada de estudio dependiente de la edad inestabilidad genómica. Por ejemplo, las células pasivas, y no en reposo, puede ser aislado de la levadura de la fase estacionaria culturas utilizando el método de gradiente de densidad descrita por Allen et al. 23. Combinado con los ensayos de mutación descrita aquí, nos han informado de que una gran parte de los dependientes de la edad se debe a mutaciones en células en reposo, en lugar de la división, las células dañadas o apoptosis 20,24.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a S. Robertson Jinks y Heidenreich E. para proporcionar plásmidos y cepas de levadura, P. Pham y Goodman MF ayuda conel ensayo TLS. Este trabajo fue apoyado, en parte, por la Federación Americana para la Investigación del Envejecimiento de subvención y por el NIH AG20642, AG025135.
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