Studera age-dependent genomisk instabilitet med S. cerevisiae Kronologisk Livslängd Modell

Summary

Här beskriver vi ett antal tester DNA mutation som kan kombineras med jästen kronologiska livslängd modell för att studera de gener / vägar som reglerar eller bidrar till att arvsmassans DNA instabilitet under åldrandet.

Abstract

Studier med Saccharomyces cerevisiae åldrande modell har upptäckt livslängd reglerande vägar som delvis bevaras i högre eukaryoter ^1-2. Enkelheten och makt jästen åldrande modellen kan också undersökas för att studera DNA-skador och arvsmassan underhåll samt deras bidrag till sjukdomar under åldrandet. Här beskriver vi ett system för att studera åldersberoende DNA-mutationer, inklusive bas substitutioner, ram-shift mutationer, brutto kromosomala omdisponeringar och homolog / homeologous rekombination samt nukleärt DNA reparation verksamheten genom att kombinera jästen span kronologisk liv med enkelt DNA- skador och analyser mutation. De metoder som beskrivs här bör underlätta identifieringen av gener / vägar som reglerar genomisk instabilitet och de mekanismer som ligger bakom åldersberoende DNA-mutationer och cancer hos däggdjur.

Protocol

Två livslängd modeller har används för att studera åldrandet i S. cerevisiae: RLS och CLS. Den replikationsförmåga (blivande) livslängd (RLS) är baserad på konstaterandet att jästen mamma celler genomgå ett ändligt antal divisioner ^3-6. Vi kommer att fokusera på i vilken livslängd (CLS), en modell baserad på den kronologiska överlevnad inte dela jästen i kultur eller på tallrikar ^7-11. Vildtyp jäst växer exponentiellt i 10-12 timmar i syntetiska glukos fullständig (SDC) medium . När glukos nivå minskar, jäst växlar från jäsning till andning, kallas en process diauxic skift. Celler fortsätter att dela långsamt under efter diauxic fas för cirka 48 timmar före inträde i G ₀ gripande. Den ämnesomsättning i cellerna är fortsatt hög fram till dag 5-6 (dag 0 är ympning dag). Cellviabiliteten över tid kan nås genom att den andel av kronologiskt åldrande celler, provtas varannan dag, vilket kan avsluta G ₀ gripandet och bilda kolonier på rika YPED tallrikar.

1. Jäst kronologisk livslängd (CLS) i flytande kultur

1. Inokulera ett enda samhälle i 1 ml syntetiskt komplett glukos medium (SDC, tabell 1) och inkubera över natten med skakning (220 rpm) vid 30 ° C. Tre inoculums från oberoende kolonier bör upprättas för varje stam för att ge biologiska repliker.
2. Späd natten kulturen till frisk SDC medium (vanligtvis 10 ml) till OD = 0,05 till 0,1 (~ 1:100 utspädning) och inkubera med skakning (220 rpm) vid 30 ° C. Denna tidpunkt anses dag 0 i den kronologiska åldrande. Behåll ett 01:05 förhållandet kultur / kolv volym (10 ml kultur i 50 ml, eller för längre / större experiment 25 ml kultur i 125 ml) för att säkerställa korrekt luftning.
3. Från dag 3, ta bort 2 portioner av 10 ìl från, späd 10.000 gånger i autoklaveras vatten, 10 l utspädd kultur (dvs. 10 ⁴ -10) på YEPD (1% jästextrakt, 2% Bacto pepton, 2% dextros , 2% agar) plattor, och inkubera vid 30 ° C under 48-72 timmar innan kolonibildande förena (CFU) räknas.
4. Dag 3 CFU anses vara 100% överlevnad. Utspädning faktorer av åldrande kulturen i den efterföljande dagar bör justeras för att säkerställa ~ 20-100 kolonier i CFU analysen (t ex 10 ⁴ -10, 10 ⁴ -30, 10 ³ -10 mm). För vildtyp celler i DBY746 bakgrunden når CLS 1% överlevnad omkring dag 11.

Variationer av in situ livskraft analysen är:

• Kalorirestriktion (CR) med glukos begränsning. Spädning av natten kultur i glukos begränsad SC medium (till exempel 0,5 eller 0,05% istället för de vanliga 2% glukos) leder generellt till lägre befolkningen mättnad täthet på dag 3, men mycket längre betyder och maximal (10% överlevnad) livslängd ^12.
• För extrema CR / svält, tvätta dag 3 stationära fasen kultur (vanligtvis 10 ml, som i steg 3 ovan) med autoklaveras vatten (resuspendera celler i samma mängd vatten och spinn ner vid 2500 rpm i 5 min, upprepa 3 gånger). Incubationof celler i vattnet härmar svält villkoret att jäst kan stöta på i naturen. Var två dagar senare, bör åldrande kultur tvättas med autoklaveras vatten och suspenderade i lika stor volym vatten för att avlägsna alla näringsämnen frigörs från lyserade döda celler. Utför livskraft analys genom provtagning den åldrande kultur som beskrivs ovan. Detta svält villkor kommer ledde till nästan en fördubbling av den genomsnittliga CLS i vildtyp DBY746 stam ^12.

2. In situ lönsamheten analys

I vätskan kulturen, kan en liten del av de överlevande cellerna åter in i cellcykeln och växa utnyttja resterande näringsämnen eller de släppt formen lyserade döda celler i mediet, en fenotyp kallas återväxt / flämtar ^13. Vi utvecklade en livskraft-on-a-platta system som utnyttjar auxotrophy av DBY746 stam (trp1) för att kringgå återväxt / flämtande problem och också göra det möjligt att testa effekten av kontinuerlig exponering eller förlust av olika externa näringsämnen eller stimuli på jäst CLS ^11. Detta på plats livskraft analys härmar också replikationsförmåga livslängd modell så att celler ständigt utsätts för riklig näring under hela livslängden analysen.

1. Inokulera ett enda samhälle i 1 ml syntetiskt komplett glukos medium (SDC) och inkubera över natten med skakning (220 rpm) vid 30 ° C. Minst tre inoculums från oberoende kolonier bör upprättas för varje stam för att ge biologiska repliker.
2. Låt kulturen växa till ~ 10 ⁸ celler / ml (OD ₆₀₀ = ~ 10), späd culturewith autoklaveras vattnet till 100-200 cell/10 l (vanligtvis 10 ^4-faldig utspädning) och 1000 cells/10 l (10 ³ -faldig utspädning).
3. Plate två alikvoter av 10-30 l utspädd kultur på ett tryptofan avhopp SDC plattan. Förr varje stam, utarbeta en serie på 8 till 20 tallrikar och märkt med plätering densitet (t.ex. 10 ^4-faldig utspädning, tallrik 10 l eller 10 ⁴ -10, 10 ⁴ -30, 10 ³ -10, 10 ³ -30 etc.), som garanterar 10-100 kolonier kan räknas i väntan på minskade lönsamheten under åldrandet.
4. Inkubera plattan inställd på 30 ° C under hela livslängden analysen.
5. På dagen för bordläggning och varje 2 dagar senare, ta bort en plåt och droppvis Tillsätt 0,5 ml Tryptofan (2 mg / ml) så att livskraftiga celler att växa. Inkubera plattan vid 30 ° C i ytterligare 48-72 timmar. Räkna CFU för lönsamheten på dagen för tryptofan tillägg. Den CFU på dagen för plätering anses 100% överlevnad.

Variationer av in situ livskraft analysen är:

• Ålder celler på agarplattor (extrem svält tillstånd). Tillsätt 1 ml 2x YPED istället för tryptofan på efterföljande dagar för att möjliggöra tillväxt och CFU-antalet ^14.
• Ålder celler på plattor med tryptofan avhopp syntetiskt komplett medium med olika kolkällor, t.ex. olika koncentrationer av glukos (kalorirestriktion med glukos begränsning), olika källor koldioxid som etanol, glycerol, ättiksyra ^14. Tillsätt 1 ml glukos / tryptofan lösning (20% glukos och 1mg/ml tryptofan) för att möjliggöra tillväxt och CFU räknas.
• Andra näringsämnen manipulation, som kväve.

3. DNA-skador och mutationsfrekvensen under kronologiskt åldrande

Canavanine motstånd (Kan ^r) och can1 sekvensering
Spontan mutationsfrekvensen kan utvärderas genom att mäta frekvensen av canavanine motstånd (Kan ^R) i kronologiskt åldrande kulturer. Mutationer i CAN1 (YEL063) genen som kodar plasma-arginin permease, gör som är resistenta mot de arginin analoga L-canavanine.Can ^r kolonier samlas in vid olika tidpunkter kan också sparas för utvinning av arvsmassans DNA och efterföljande sekvensering av CAN1 gen, som kan lämna uppgifter mutation spektrum (med Mutation Lantmätare, SoftGenetics).

Base substitutioner (Trp ⁺ återgångar)

Stammar med trp1-289 innehåller en gul mutation (C403T) i TRP1 kodande sekvens. Mätning av frekvens av trp1-289 till Trp ⁺ reversion ¹⁵ gör uppskattningen av basen substitution takt under jäst kronologisk åldrande.

Ram-shift mutationer

De Lys ^- stam EH150 (Mata, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200, ura3-52, ade2-1o) hamnar en lys2ΔBgl II mutation som byggdes genom att sätta in 4 nukleotider för att skapa en BGL II webbplats begränsning enzym i LYS2 genen . Den resulterande fyra skift i Öppna resultat läsram i auxotrophy för lysin som kan motverkas av små insättning / deletionsmutationer ^16-17.

Gross kromosomal omorganiseringar (GCRs)

För att upptäcka grova kromosomala omdisponeringar (GCRs) genererade vi en mutant stam, där HXT13 (YEL069), kodning ett mycket redundant hexose transportör, stördes av en URA3 kassett ^18. Ligger 7,5 kb telomeric att CAN1 på kromosom V. Mutationer HXT13 i både CAN1 och URA3 gener gör cellerna resistens mot L-canavanine och 5-fluoroorotic syra (5FOA), respektive. Med tanke på den låga frekvensen av punktmutationer som förekommer i både gener, analys av Can ^r 5FOA ^r frekvens ger en uppskattning av GCRs som resulterar i förlust av både gener.

Homologa och homeologous rekombination

Att övervaka nivån av homologa (100%) och homeologous rekombination (91%) under kronologiska åldrande, genererade vi mutanter där linjäriserade plasmider (HIS3:: intron-IR-URA3) bär antingen 100% homologa inverterade upprepningar (IRS) (pSR406 ) eller 91% homeologous IRS (pSR407) vid HIS3 locus ^19. Rekombination mellan IRS ger uttryck för funktionella His3 protein.

1. Parallellt med normal lönsamhet analys (enligt ovan), ta en lämplig mängd celler från åldrande kultur,
   1. för Can ^r mutation, börja med ~ 2x10 ⁷ celler (200 l dag 3 kultur);
   2. för TRP ⁺ återgång, börjar med ~ 10 ⁸ celler (500-1000 l dag 3 kultur);
   3. för Lys ⁺ frame-shift mutation, börja med ~ 10 ⁸ celler (500-1000 l dag 3 kultur);
   4. för GCRs, börja med 2-3x10 ⁸ celler (2-3 ml dag 3 kultur);
   5. för homologa och homeologous rekombination, börja med & tilde; 5x10 ⁷ celler (200-500 l dag 3 kultur);
   justera plating belopp enligt minskningen av den totala lönsamheten och den ökning av mutationsfrekvensen under kronologiska åldrande (tabell 2). I händelse av stammar med hypermutator fenotyp (som de med brister i DNA-reparation), minska provtagningen beloppet därefter.
2. Pellets cellerna med bordsskop centrifug maskin (6000 rpm i 5 min).
3. Resuspendera cellerna i 1 ml autoklaveras vatten och pellets cellerna igen.
4. Resuspendera cellpelleten i 100 l vatten. Plate celler,
   1. för Can ^r mutation på arginin-avhopp syntetiskt komplett medelstora plattor (SDC-Arg, kompletterad med 60 mikrogram / ​​ml L-canavanine sulfat);
   2. för TRP ⁺ återgång, om tryptofan-avhopp plattor (SDC-TRP);
   3. för Lys ⁺ frame-shift mutation på lysin-avhopp plattor (SDC-Lys);
   4. för GCRs på arginin-avhopp plattor (SDC-Arg) kompletterat med 5FOA (1 mg / ml) och L-canavanine sulfat (60 mikrogram / ml);
   5. för homologa och homeologous rekombination, på histidin-avhopp plattor kompletteras med galaktos (2%).
5. Räkna CFUs efter 3-4 dagars inkubation vid 30 ° C. Den mutationsfrekvensen normaliseras till antalet livskraftiga celler.

Komplement till den på plats livskraft analys, åldersberoende Trp ⁺ återgång, Lys ⁺ frame-shift mutation, rekombination eller kan ^r kan också studeras i celler åldern på tallriken.

1. Tavla celler (~ 10 ⁸ celler / platta) på TRP-, Lys-, Hans-bortfall, eller L-canavanine syntetiskt komplett medelstora plattor (enligt ovan).
2. Varannan dag (eller vid tidpunkten av intresse) poäng den nya framväxande kolonierna.
3. Mutationsfrekvensen beräknas genom att normalisera nya framväxande kolonierna till det totala antalet livskraftiga celler av de specifika dagen.

4. Translesion syntes (TLS)

Den åldersberoende mutationsfrekvensen ökning kan innebära ökad makromolekyl skador, minskat cellulärt skydd / reparation, och ökade felaktig DNA-reparation (t.ex. Polζ beroende translesion syntes, TLS) under åldrandet. Till exempel den långlivade sch9 Δ mutanter uppvisar förhöjda uttryck av SOD2 och minskat uttryck för felbenägen DNA-reparation enzym Rev1 ^20. Här beskriver vi en analys som kombinerar skadat DNA-mall och hela nukleära extrakt för att utvärdera TLS in vitro.

1. Förbered nukleära extrakt som beskrivs av Wang et al ^21,. Kvantifiera proteinkoncentration av BCA analys (Pierce).
2. Lägg till 0, 5, 10 eller 20 mikrogram av nukleära extrakt till 50 l (slutlig volym) reaktioner som innehåller TLS buffert (20 mM HEPES, 7 mm MgCl _2, 1 mm DTT, 25 mM NaCl, pH 7,8), 200 μMdNTPs och 100 nM ^5'-32 P-märkta 12-Mer grundfärg (5'-CGA TGG TAC GGA-3 ') glödgas till en 48-Mer-mall som innehåller DNA-skada av intresse (5'-TCG ATA CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC ACG TCC GTA CCA TCG-3 ", där X är den skadade platsen, t.ex. abasic plats, 8-oxo-G, osv).
3. Inkubera blandningen vid 30 ° C i 30 min, avsluta reaktionen med tillägg av 2,5 l EDTA (20 mm) och 2 ìl proteinas K (10 mg / ml).
4. Rena DNA med fenol extraktion och etanol nederbörd.
5. Resuspendera DNA i 50 l gel loading buffert (98% formamid, 20 mM EDTA och färg).
6. Lös translesion syntes produkter på 19% polyakrylamidgeler.
7. Kvantifiera TLS med phosphorimaging (Figur 1).

5. Representativa resultat

Vi använde normalt CFU räknar på dag 3 som 100 procent överlevnad i modellvätska CLS analys. Andelen överlevnad i den efterföljande dagarna kan monteras för att beräkna medelvärdet (50% överlevnad) och max (10% överlevnad) livslängd ^12. Livslängd resultat från in situ livskraft-analysen är generellt överensstämmande med de som använder flytande CLS-analysen, men med reducerad medelvärdet livslängd, vilket beror delvis på det faktum att celler ständigt utsätts för näringsämnen. Förekomst av glukos hämmar aktiviteten av cellulär skydd som visade genom den minskade transactivation av stress transkriptionsfaktor som Msn2 / 4 och Gis1 ^12.

Åldersberoende mutationsfrekvensen varierar stort beroende på belastningen bakgrund, genetisk manipulation, villkor kultur och ålder. Tabell 2 visar typiska resultat som erhållits vid vildtyp stam (DBY746).

Komponent	g / L
D-glukos	20
Ammoniumsulfat	5
Kväve bas (-AS/-AA)	1,8
NaH2PO4	1,4
	mg / L
Adenin	80
L-arginin	40
L-Asparaginsyra	100
L-glutaminsyra	100
L-histidin	80
L-isoleucin	60
L-Leucin	120
L-Lysin	60
L-Metionin	80
L-Fenylalanin	60
L-Serine	400
L-treonin	200
L-Tryptofan	80
L-Tyrosin	40
L-Valin	150
Uracil	80

Tabell 1. Syntetiska komplett glukos medium, SDC (justera till pH 6,0 med NaOH). 4-faldigt högre än histidin, är leucin, tryptofan, och uracil med för att kompensera auxotrophy av DBY746 påfrestningar.

	Dag 3 (medelvärde ± SEM)	Upp till (under åldrandet)
Kan r	1,76 ± 0,12 x10 -6	6-8 x10 -6
Trp + reversion	6,60 ± 1,70 x10 -8	1,60 x10 -6
Lys + frame-shift mutation	3,00 ± 0,78 x10 -8	0,70 x10 -6
GCRs	0,62 ± 0,10 x10 -8	0,30 x10 -6
Homolog rekombination	5,55 ± 2,74 x10 -6	27,00 x10 -6
Homeologous rekombination	0,12 ± 0,04 x10 -6	0,48 x10 -6

Tabell 2. Typiska mutation frekvenser av vild typ celler (DBY746) under kronologiska åldrande.

Figur 1. Resultat av translesion syntes (TLS) ^20. Kärn utdrag ur 3 dagsgamla stationär fas vildtyp (DBY746) och sch9 Δ muterade celler inkuberades med oskadat eller abasic webbplats som innehåller DNA-mallar för 30 minuter vid 30 ° C. TLS produkter anges med fast (med oskadat mall) eller prickade (med skadade mall) linjer. Det fanns ingen translesion syntes observerats i nukleära extrakt från sch9 Δ mutanter. Gratis grundfärger indikeras av de öppna pilen.

Discussion

Flytande åldrande kulturer uppvisar någon gång återväxt / kippar fenotyp ^13, vilket komplicerar CLS analysen. Återväxt inträffar vanligen när mer än 90-99% av befolkningen har förlorat bärkraft. Denna fenotyp förknippas ofta med ökad oxidativ stress och / eller minskad skydd i cellen. Till exempel frekvensen av denna fenotyp mer än fördubblas i celler som saknar cytosoliskt superoxiddismutas och kraftigt minskar i långlivade mutanter (t.ex. sch9 Δ eller ras2 Δ) eller mutanter överuttryck av superoxid dismutases ^22. I praktiken definierar vi återväxt som en ökning av livskraften eller stabilisering av lönsamheten för tre på varandra följande provtagningar i den höga dödligheten fas under kronologiska åldrande.

Åldersberoende frekvenserna av olika DNA-mutationer variera kraftigt beroende på belastningen bakgrund, genetisk manipulation, villkor kultur, samt återväxt / flämtar och extremt låg överlevnad. Pre-experiment bör utföras vid tidpunkter som medelvärdet och maximal överlevnad med olika plätering densitet för mutationsanalyserna att avgöra utbud mutationsfrekvensen innan performingthe full skala livslängd analys. Den vilda stammen ska alltid ingå i en livslängd eller mutationsfrekvensen studera parallellt med någon behandling eller genetisk mutant, så att mellan experiment-variationer kan redovisas. Flera biologiska kopior bör ingå i studien, och, både flytande och in situ viabilitet / mutationsanalyserna bör utföras för att bekräfta resultaten.

Istället för att fokusera på en viss typ av DNA-mutation, profilering av åldersberoende genomisk instabilitet med flera analyser i kombination, kan belysa specifika DNA-skador och DNA-skador repareras System (s) som bidrar till åldersberoende genomisk instabilitet. Till exempel är en betydande ökning av brutto-kromosomala omdisponeringar (GCRs), jämfört med de andra DNA-mutationer, som observerats i vild typ jäst antyder en elevationof dubbel tråd sönder och / eller en försämring i icke-homologa slut att gå (NHEJ) under jäst kronologiska åldrande (tabell 2). Den can1 mutationen spektrum (sekvensering av CAN1 genen) som erhållits i vildtyp åldrande jäst föreslås en ökning av oxidativ skada under kronologiskt åldrande och felbenägen DNA-reparation, I långlivade sch9 Δ mutanter, mindre oxidativa DNA-skador och mycket reducerad felbenägna translesion syntes observerades ^20.

Metoder som beskrivs här kan ytterligare ner på att studera åldersberoende genomisk instabilitet. Till exempel kan oföretagsam och icke-vilande celler isoleras från jäst stationära-fas kulturer med metoden densitetsgradient beskrivs av Allen et al. ^23. Kombinerat med mutationsanalyserna beskrivs här har vi rapporterat att en stor del av åldersberoende mutationer uppstår vilande celler, i stället för att dela, skadade eller apoptotiska celler ^20,24.