Summary
Здесь мы опишем набор мутации ДНК анализов, которые могут быть объединены с жизнью дрожжей хронологический промежуток модель для изучения генов / путей, которые регулируют или способствовать нестабильности генома ДНК в процессе старения.
Abstract
Исследования с использованием CEREVISIAE Saccharomyces старения модель обнаружили жизни регулирующих способов, которые частично сохраняются у высших эукариот 1-2. Простота и сила дрожжей старения модель может также изучить, в исследовании повреждения ДНК и генома обслуживания, а также их вклад в заболевания в процессе старения. Здесь мы описываем системы для изучения возрастных мутаций ДНК, в том числе базы замены, сдвига рамки мутации, валовой хромосомных перестроек, и гомологичные / homeologous рекомбинации, а также ядерной деятельности репарации ДНК путем объединения жизни дрожжей хронологический промежуток с простыми ДНК повреждения и мутации анализов. Методы, описанные здесь, должны способствовать выявлению генов / путей, которые регулируют геномной нестабильности и механизмов, лежащих в основе возрастных мутаций ДНК и рак у млекопитающих.
Protocol
Две жизни модели используются для изучения старения в С. CEREVISIAE: РЛС и CLS. Репликативной (начинающие) срок службы (РЛС) основана на наблюдении, что дрожжевые клетки матери проходят конечное число делений 3-6. Мы сосредоточимся на хронологический срок службы (CLS), модель, основанная на хронологическом выживания без деления дрожжей в культуре или по тарелкам 7-11. Дикие дрожжи типа растет в геометрической прогрессии в течение 10-12 часов в синтетических декстрозы полной (SDC) среде . Когда уровень глюкозы снижается, дрожжи переключается из ферментации дыхание, процесс, который называют diauxic смену. Клетки продолжают делиться медленно во время пост-diauxic фазы в течение примерно 48 часов перед входом G 0 ареста. Уровень метаболизма клеток остается высоким до дня 5-6 (день 0 является прививка день). Жизнеспособность клеток с течением времени могут быть доступны процент хронологически старения клеток, пробы каждые два дня, которые могут выйти G 0 ареста и образовывать колонии на богатых YPED пластин.
1. Дрожжи хронологический срок службы (CLS) в культуральной жидкости
- Привить одной колонии в 1 мл синтетического полной среде глюкозу (SDC, таблица 1) и инкубировать в течение ночи при встряхивании (220 оборотов в минуту) при температуре 30 ° C. Три inoculums от независимых колоний должны быть подготовлены для каждого штамма обеспечить биологическую реплик.
- Развести ночной культуры в свежую среду SDC (обычно 10 мл), OD = 0,05-0,1 (~ 1:100 разведение) и инкубировать при встряхивании (220 оборотов в минуту) при температуре 30 ° C. На этот раз точка считается день 0 хронологического старения. Поддерживать соотношении 1:5 культуры / колбы объемом (10 мл культуры в 50 мл, или на более длительный / большие эксперименты 25 мл культуры в 125 мл) для обеспечения надлежащей вентиляции.
- Начиная с 3-й день, удалить 2 аликвоты 10 мкл из колбы, развести 10000 раз в автоклаве воды, 10 мкл разведенного культуры (т. е. 10 4 -10) на YEPD (1% дрожжевой экстракт, 2% Бакто пептон, 2% раствором декстрозы , 2% агара), плиты, и инкубировать при 30 ° С в течение 48-72 часов до колониеобразующих объединиться (CFU) учитывается.
- День 3 КОЕ считается 100% выживаемости. Разведение факторов старения культуры в последующие дни должны быть соответствующим образом скорректированы для обеспечения ~ 20-100 колоний в анализе КОЕ (например, 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10 и др.). Для дикого типа в клетки DBY746 фон, CLS достигает 1% выживаемости около 11-й день.
Вариации на месте анализа жизнеспособности включают в себя:
- Ограничение калорий (CR) глюкозой ограничений. Разбавление ночной культуры в среде глюкозы ограниченной SC (например, 0,5 или 0,05% вместо стандартных 2% глюкозы) в целом приводит к снижению плотности населения насыщения на 3 день, но значительно расширена средняя и максимальная (10% выживаемости) срок службы 12.
- Для экстремальных CR / голода, мыть день 3 стационарных культуры фазы (как правило, 10 мл, как в шаге 3 выше) с автоклавного воды (ресуспендирования клеток равным объемом воды и спин вниз на 2500 оборотов в минуту в течение 5 минут, повторите 3 раза). Incubationof клетки в воде имитирует голода условии, что дрожжи могут столкнуться в дикой природе. Каждые два дня впоследствии, старение культуры должны быть промыты водой автоклавного и ресуспендировали в равном объеме воды, чтобы удалить какой-либо питательных веществ, освобождается от отмерших клеток лизируется. Выполнить анализ жизнеспособности путем отбора проб старения культуры, как описано выше. Это условие будет голод привели к почти удвоению среднего CLS с диким типом DBY746 штамма 12.
2. На месте анализа жизнеспособности
В жидкой культуре, малая доля выживших клеток могут вновь вошел в клеточный цикл и расти используя оставшиеся питательные вещества, или те, освобождается от отмерших клеток лизируется в среде, называется фенотипом отрастания / задыхаясь 13. Мы разработали жизнеспособность-на-пластина системы, которая использует auxotrophy из DBY746 деформации (TRP1), чтобы обойти отрастания / задыхаясь задачи, а также позволяют тестирование эффект постоянного воздействия или лишение различных внешних питательных веществ или стимулов на дрожжах CLS 11. Это, в месте анализа жизнеспособности также имитирует модель репликативной продолжительности жизни, что клетки постоянно подвергаются обильным питательных веществ в течение всего срока анализа продолжительности жизни.
- Привить одной колонии в 1 мл синтетического полной среде глюкозу (SDC) и инкубировать в течение ночи при встряхивании (220 оборотов в минуту) при температуре 30 ° C. По меньшей мере три inoculums от независимых колоний должны быть подготовлены для каждого штамма обеспечить биологическую реплик.
- Давайте культуры вырастет до ~ 10 8 кл / мл (OD 600 = ~ 10), развести culturewith автоклавного воды до 100-200 cell/10 мкл (обычно 10 4-кратное разбавление) и 1000 cells/10 мкл (10 3 -кратного разбавления).
- Пластина две аликвоты 10-30 мкл разведенной культуры на одной пластине триптофан отсева SDC. ДляГ каждого штамма, подготовить набор из 8 до 20 пластин и маркированы в соответствии с плотностью покрытия (например, 10 в 4 раза разбавленным, пластины 10 мкл или 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, 10 3 -30 и т.д.), которые обеспечивают 10-100 колоний можно пересчитать в ожидании снижения жизнеспособности в процессе старения.
- Инкубируйте пластина установлена на уровне 30 ° С в течение всего срока анализа продолжительности жизни.
- В день посева и каждые 2 дня, затем удалить одну пластину и по каплям добавляют 0,5 мл Триптофан (2 мг / мл), чтобы жизнеспособные клетки расти. Инкубируйте планшет при 30 ° С в течение дополнительных 48-72 часов. Граф КОЕ на жизнеспособность в день того триптофан. КОЕ в день покрытие считается 100% выживаемости.
Вариации на месте анализа жизнеспособности включают в себя:
- Возраст клеток на агар пластин (экстремальных условиях голода). Добавить 1 мл 2 раза YPED вместо триптофана в последующие дни, чтобы рост и КОЕ счет 14.
- Возраст клеток на пластинах с триптофаном отсева синтетических полной среде с различными источниками углерода, например, различные концентрации глюкозы (ограничение калорий глюкозой ограничения), различные источники углерода, такие как этанол, глицерин, уксусную кислоту 14. Добавьте 1 мл глюкозы / триптофан раствор (20% глюкозы и 1mg/ml триптофан), чтобы рост и КОЕ считается.
- Другие питательные манипуляции, такие как азот.
3. Повреждение ДНК и частоты мутаций в хронологическом старения
Canavanine сопротивления (Может г) и секвенирования can1
Спонтанная частота мутаций может быть оценена путем измерения частоты canavanine сопротивления (Может г) в хронологическом старения культур. Мутации в CAN1 (YEL063) гена, который кодирует плазма аргинина permease, оказывают клетки устойчивыми к аргинин аналог L-canavanine.Can т колонии собраны в различные моменты времени могут быть сохранены для извлечения геномной ДНК и последующего секвенирования CAN1 ген, который может обеспечить мутации спектр данных (с Мутация Surveyor, SoftGenetics).
База замен (Trp + реверсия)
Штаммы с TRP1-289 содержат мутацию янтаря (C403T) в TRP1 кодирующей последовательности. Измерение частоты TRP1-289 для Trp + возврат 15 позволяет оценить базовую ставку замены в течение дрожжей старения хронологическом порядке.
Каркасно-сдвиг мутации
Lys - штамм EH150 (Мата, lys2ΔBglII, TRP1-Δ, his3-Δ200, URA3-52, ade2-1o) гаваней lys2ΔBgl мутации II, который был построен, вставив 4 нуклеотидов создать ограничение Bgl II фермента сайта в LYS2 гена . В результате +4 сдвиг в открытой рамки считывания результатов в auxotrophy для лизина, которые могут быть отменены небольшие вставки / удаления мутации 16-17.
Валовой хромосомных перестроек (ГКЛ)
Для определения валового хромосомных перестроек (ГКЛ), мы получили мутантный штамм, в котором HXT13 (YEL069), кодирование высоко избыточные гексоз транспортер, была нарушена URA3 кассеты 18. HXT13 находится 7,5 кб теломерных к CAN1 на хромосоме В. Мутации в обоих CAN1 и URA3 генов клетки оказывают сопротивление L-canavanine и 5-fluoroorotic кислоты (5FOA), соответственно. Учитывая низкую частоту точечные мутации, которые происходят в обоих генов, анализ Может 5FOA т т частоты обеспечивает оценку ГКЛ, что приведет к потере обоих генов.
Гомологичные и homeologous рекомбинации
Для контроля уровня гомологичных (100%) и homeologous рекомбинации (91%) в течение хронологического старения, мы получили мутанты, в которых линеаризованной плазмиды (HIS3:: интрон-ИК-URA3), несущих 100% гомологичными инвертированные повторы (IRS) (pSR406 ) или 91% homeologous IRS (pSR407) на HIS3 локус 19. Рекомбинация между НП позволяет выразить функциональный белок His3.
- Параллельно с нормальным анализа жизнеспособности (как описано выше), удалить соответствующее количество клеток от старения культуры,
- для мутации Может г, начинаются с ~ 2х10 7 клеток (200 мкл 3-й день культуры);
- для возврата Trp +, начните с ~ 10 8 клеток (500-1000 мкл 3-й день культуры);
- для Lys + сдвига рамки мутации, начните с ~ 10 8 клеток (500-1000 мкл 3-й день культуры);
- для ГКЛ, начните с 2-3х10 8 клеток (2-3 мл 3-й день культуры);
- для гомологичной рекомбинации и homeologous, начните с & тильда; 5х10 7 клеток (200-500 мкл 3-й день культуры);
- Гранул клеток с настольная машина центрифуга (6000 оборотов в минуту в течение 5 мин).
- Ресуспендируют клеток в 1 мл автоклавного воды и гранул клетки снова.
- Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл воды. Пластина клетки,
- Может для т мутации, на аргинин-отсева синтетических полный пластин среды (SDC-Arg, дополненной 60 мкг / мл L-canavanine сульфата);
- для возврата Trp +, на триптофан-отсева пластин (SDC-Trp);
- для Lys + сдвига рамки мутация, по лизин-отсева пластин (SDC-Lys);
- для ГКЛ, на аргинин-отсева пластин (SDC-Arg) с добавлением 5FOA (1 мг / мл) и L-canavanine сульфата (60 мкг / мл);
- для гомологичной рекомбинации и homeologous, на гистидин-отсева пластин дополнен галактозы (2%).
- Граф CFUs после инкубации 3-4 дней при температуре 30 ° C. Частота мутаций нормирована на количество жизнеспособных клеток.
В дополнение к на месте анализа жизнеспособности, возраст-зависимых Trp + реверсии, Lys + сдвига рамки мутации, рекомбинации, или Может г может быть исследована в клетках, в возрасте от пластины.
- Пластина клеток (~ 10 8 клеток / пластину) на Trp-, Lys-Его-отсева, или L-canavanine синтетических полный пластин среды (как описано выше).
- Каждые два дня (или в момент достопримечательность), оценка вновь возникающих колоний.
- Мутация частота оценивается нормализации вновь возникающих колонии общего числа жизнеспособных клеток определенный день.
4. Translesion синтеза (TLS)
Возраст-зависимых частоты мутаций может привести к увеличению увеличился макромолекулы повреждений, уменьшилось сотовой защиты / восстановления и увеличения ошибочной репарации ДНК (например, Polζ-зависимый синтез translesion, TLS) в процессе старения. Например, долгоживущие sch9 Δ мутантов выставку повышенную экспрессию SOD2, а также снижение экспрессии ошибок репарации ДНК фермент rev1 20. Здесь мы опишем анализ сочетания повреждений ДНК-матрицы и весь ядерный экстракт оценить TLS в пробирке.
- Подготовка ядерный экстракт, как описано Ван и др. 21;. Количественно концентрации белка по BCA анализа (Pierce).
- Добавить 0, 5, 10 или 20 мкг ядерных экстрактов до 50 мкл (конечный объем) реакции содержащие TLS буфера (20 мМ HEPES, 7 мМ MgCl 2, 1 мМ DTT, 25 мМ NaCl, рН 7,8), 200 μMdNTPs и 100 нм 5'-32 P-меченых 12-Мер праймера (5'-CGA TGG TAC GGA-3 ') отожженного до 48-Мер шаблон, содержащий повреждение ДНК, представляющие интерес (5'-TCG ATA КТГ GTA CTA ATG ATT AAC GAC ТХА AGC ACG TCC GTA ОСО TCG-3 », в которой X является поврежденный участок, например, abasic сайт, 8-оксо-G и т.д.).
- Выдержите смесь при температуре 30 ° С в течение 30 мин, прекратить реакции с добавлением 2,5 мкл ЭДТА (20 мм) и 2 мкл протеиназы К (10 мг / мл).
- Purify ДНК с фенолом добычи и осаждением этанолом.
- Ресуспендируют ДНК в 50 мкл буфера загрузки гель (98% формамида, 20 мМ ЭДТА, и краситель).
- Решение translesion продуктов синтеза на 19% гель полиакриламида.
- Количественная TLS использованием phosphorimaging (рис. 1).
5. Представитель Результаты
Мы обычно используется КОЕ рассчитывает на 3-й день, как на 100 процентов выживания в стандартных анализа жидкостей CLS. Процент выживания в последующие дни могут быть установлены для расчета среднего (50% выживаемости) и максимальный (10% выживаемости) продолжительность жизни 12. Продолжительность жизни результаты, полученные на месте анализа жизнеспособности в целом согласуются с тех, кто использует жидкий анализа CLS, но с уменьшенной средней продолжительности жизни, что связано отчасти с тем, что клетки постоянно подвергаются питательные вещества. Наличие глюкозы ингибирует активность клеточных защиты, как показал на снижение трансактивацию стрессовую реакцию транскрипционных факторов, таких как Msn2 / 4 и Gis1 12.
Зависящими от возраста частота мутаций сильно варьируется в зависимости от штамма фон, генетические манипуляции, условия культивирования и возраста. В таблице 2 приведены типичные результаты, полученные в штамма дикого типа (DBY746).
| Компонент | г / л |
|---|---|
| D-глюкозы | 20 |
| Сульфат аммония | 5 |
| Азот базы (-AS/-AA) | 1,8 |
| NaH2PO4 | 1,4 |
| мг / л | |
| Аденин | 80 |
| L-аргинин | 40 |
| L-Аспарагиновая кислота | 100 |
| L-глутаминовая кислота | 100 |
| L-Гистидин | 80 |
| L-изолейцин | 60 |
| L-лейцин | 120 |
| L-лизин | 60 |
| L-метионина | 80 |
| L-фенилаланин | 60 |
| L-серин | 400 |
| L-Треонин | 200 |
| L-триптофан | 80 |
| L-тирозин | 40 |
| L-валин | 150 |
| Урацил | 80 |
Таблица 1. Синтетический полной среде глюкозы, SDC (приспособиться к рН 6,0 с NaOH). 4-кратное превышение гистидин, лейцин, триптофан и урацил включены, чтобы компенсировать auxotrophy из DBY746 напряжения.
| День 3 (среднее ± SEM) | До (при старении) | |
|---|---|---|
| Может т | 1,76 ± 0,12 x10 -6 | 6-8 х10 -6 |
| Trp + возврат | 6,60 ± 1,70 х10 -8 | 1,60 х10 -6 |
| Lys + сдвига рамки мутации | 3,00 ± 0,78 х10 -8 | 0,70 х10 -6 |
| ГКЛ | 0,62 ± 0,10 х10 -8 | 0,30 х10 -6 |
| Гомологичной рекомбинации | 5,55 ± 2,74 x10 -6 | 27,00 х10 -6 |
| Homeologous рекомбинации | 0,12 ± 0,04 x10 -6 | 0,48 х10 -6 |
Таблица 2. Типичные частоты мутаций клетки дикого типа (DBY746) в течение хронологического старения.
Рисунок 1. Результаты translesion синтеза (TLS) 20. Ядерные экстракты из 3 дневных стационарной фазы дикого типа (DBY746) и sch9 Δ мутантных клеток инкубировали с неповрежденными или abasic сайт-шаблоны, содержащие ДНК в течение 30 мин при 30 ° С. TLS продуктов обозначены твердые (с неповрежденными шаблон) или пунктирными (с поврежденной шаблон) линий. Существовал не translesion синтез наблюдается в ядерных выписка из sch9 мутантов Δ. Бесплатный грунтовки обозначены открытые стрелки.
Discussion
Жидкие старения культур нибудь выставку отрастания / задыхаясь фенотипа 13, что затрудняет анализ CLS. Восстановление обычно происходит, когда более чем 90-99% населения утратила жизнеспособность. Этот фенотип часто ассоциируется с повышенным окислительным стрессом и / или уменьшить защиты в клетке. Например, частота этого фенотипа более чем вдвое в клетках не хватает цитозольного супероксиддисмутазы и значительно снижает в долгоживущих мутантов (например, sch9 Δ или RAS2 Δ) или мутанты гиперэкспрессией супероксид дисмутазы 22. На практике мы определяем отрастания как увеличение рентабельности или стабилизации в жизнеспособность в течение 3 последовательных выборок в фазе высокого смертности в хронологическом старения.
Возраст-зависимые частот различных мутаций ДНК сильно варьироваться в зависимости от штамма фон, генетические манипуляции, условия культивирования, а также возобновление роста / задыхаясь и крайне низкой выживаемости. Предварительно эксперименты должны проводиться во время такие пункты, как среднее и максимальное выживание с различной плотностью покрытия для мутации анализы, чтобы определить диапазон частоты мутаций, прежде чем performingthe полный анализ жизни масштабе. Дикого типа всегда должны быть включены в продолжительности жизни или учебы частоты мутаций параллельно какое-либо лечение или генетических мутантов, например, что между эксперимента-вариации могут быть учтены. Множественные биологические реплики должны быть включены в исследование, и, как жидких, так и на местах жизнеспособность / мутация анализы должны проводиться для подтверждения результатов.
Вместо того чтобы сосредоточиться на одном конкретном типе мутации ДНК, профилирование возрастной нестабильности генома с помощью нескольких тестов в комбинации, может пролить свет на конкретные повреждения ДНК и повреждение ДНК ремонт системы (систем), которые способствуют возрастные геномной нестабильности. Например, значительное увеличение валового хромосомных перестроек (ГКЛ), по сравнению с теми других мутаций ДНК, наблюдается в дикие дрожжи типа предлагая elevationof двойным разрывом нити и / или обесценения в негомологичными конце соединения (NHEJ) во время дрожжи хронологического старения (табл. 2). Can1 спектр мутаций (секвенирование гена CAN1), полученные в дикого типа старения дрожжей предложил увеличение окислительного повреждения во время хронологическое старение и ошибок репарации ДНК, тогда как в долгоживущих мутантов sch9 Δ, менее окислительных повреждений ДНК и значительно уменьшается ошибок translesion синтеза наблюдались 20.
Методы, описанные здесь могут быть дополнительно расходуется для изучения возрастных геномной нестабильности. Например, покоя и не покоящихся клеток может быть выделен из дрожжей стационарной фазы культур методом градиента плотности описывается Алленом и соавт. 23. В сочетании с мутацией анализы, описанные здесь, мы уже сообщали, что большая часть возрастных мутаций возникает из покоя клетки, а не делиться, повреждены или апоптоза клеток 20,24.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим С. Робертсон Джинкс и Е. Heidenreich за предоставление плазмид и штаммов дрожжей, П. Фама и М. Ф. Гудман за помощью анализа withthe TLS. Эта работа была поддержана, в частности, от Американской федерации по проблемам старения Исследовательский грант и AG20642 NIH, AG025135.
References
- Longo, V. D., Finch, C. E. Evolutionary medicine: from dwarf model systems to healthy centenarians. Science. 299, 1342-1346 (2003).
- Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span--from yeast to humans. Science. 328, 321-326 (2010).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183, 1751-1752 (1959).
- Muller, I., Zimmermann, M., Becker, D., Flomer, M. Calendar life span versus budding life span of Saccharomyces cerevisiae. Mech. Ageing Dev. 12, 47-52 (1980).
- Jazwinski, S. M., Egilmez, N. K., Chen, J. B. Replication control and cellular life span. Exp. Gerontol. 24, 423-436 (1989).
- Pohley, H. J. A formal mortality analysis for populations of unicellular organisms (Saccharomyces cerevisiae. Mech Ageing Dev. 38, 231-243 (1987).
- Longo, V. D., Gralla, E. B., Valentine, J. S. Superoxide dismutase activity is essential for stationary phase survival in Saccharomyces cerevisiae. Mitochondrial production of toxic oxygen species in vivo. J Biol Chem. 271, 12275-12280 (1996).
- Longo, V. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Studies of superoxide dismutase, Ras and Bcl-2 [dissertation]. , University of California Los Angeles. California Los Angeles. (1997).
- Fabrizio, P., Pozza, F., Pletcher, S. D., Gendron, C. M., Longo, V. D. Regulation of longevity and stress resistance by Sch9 in yeast. Science. 292, 288-290 (2001).
- Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2, 73-81 (2003).
- Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer. Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).
- Wei, M. Life span extension by calorie restriction depends on Rim15 and transcription factors downstream of Ras/PKA, Tor, and Sch9. PLoS Genet. 4, e13-e13 (2008).
- Fabrizio, P. Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 166, 1055-1067 (2004).
- Wei, M. Tor1/Sch9-regulated carbon source substitution is as effective as calorie restriction in life span extension. PLoS Genet. 5, e1000467-e1000467 (2009).
- Capizzi, R. L., Jameson, J. W. A table for the estimation of the spontaneous mutation rate of cells in culture. Mutat Res. 17, 147-148 (1973).
- Heidenreich, E., Novotny, R., Kneidinger, B., Holzmann, V., Wintersberger, U. Non-homologous end joining as an important mutagenic process in cell cycle-arrested cells. Embo J. 22, 2274-2283 (2003).
- Heidenreich, E., Wintersberger, U. Replication-dependent and selection-induced mutations in respiration-competent and respiration-deficient strains of Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 260, 395-400 (1998).
- Chen, C., Kolodner, R. D. Gross chromosomal rearrangements in Saccharomyces cerevisiae replication and recombination defective mutants. Nat Genet. 23, 81-85 (1999).
- Datta, A., Adjiri, A., New, L., Crouse, G. F., JinksRobertson, S. Mitotic crossovers between diverged sequences are regulated by mismatch repair proteins in Saccaromyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16, 1085-1093 (1996).
- Madia, F. Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism. J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).
- Wang, Z. Controlled expression of recombinant genes and preparation of cell-free extracts in yeast. Methods Mol Biol. 313, 317-331 (2006).
- Fabrizio, P., Pletcher, S. D., Minois, N., Vaupel, J. W., Longo, V. D. Chronological aging-independent replicative life span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 557, 136-142 (2004).
- Allen, C. Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures. J Cell Biol. 174, 89-100 (2006).
- Madia, F. Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system. J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).
