Summary
여기 노화 동안 규제 또는 게놈 DNA의 불안정성에 기여하는 유전자 / 경로를 연구하기 위해 효모 연대기 수명 모델과 결합 수의 DNA 돌연변이의 assays 집합을 설명합니다.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae의 노화 모델을 사용 연구는 부분적으로 높은 eukaryotes 1-2에 보존 아르 수명 규제 경로를 발견했습니다. 효모 노화 모델의 단순화 및 전원도 DNA 손상과 게놈 유지 보수뿐만 아니라 노화 동안 질병에 자신의 기여를 연구 탐험하실 수 있습니다. 여기서 우리는 간단한 DNA와 효모 연대기 수명을 결합하여 기본 대체, 프레임 시프트 돌연변이, 총 염색체 rearrangements, 그리고 동종 / homeologous 재조합뿐만 아니라 핵 DNA 수리 활동을 포함하여 연령에 의존 DNA 변이를 연구하는 시스템을 설명 손상과 돌연변이의 assays. 여기에서 설명한 방법은 게놈 불안정성과 포유류의 나이에 의존 DNA 변이 및 암 기초 메커니즘을 조절 유전자 / 경로의 식별을 용이하게한다.
Protocol
두 수명 모델은 미국에서 노화 연구에 사용되고있다 cerevisiae : RLS와 CLS. replicative (신진) 수명 (RLS)은 효모 어머니 세포가 분열 3-6의 유한 번호를 받아야한다는 관찰에 기반을두고 있습니다. 우리는 연대기 수명 (CLS), 문화, 또는 접시 7-11에 비 나누어 효모의 연대기 생존을 기반으로하는 모델에 초점을 맞출 것이다. 와일드 타입 효모가 합성 덱스 트로 오스 완료 (SDC) 매체 10-12시간에 대한 기하 급수적으로 증가 . 포도당 수준이 감소하면 발효 효모에서 호흡하는 스위치는 프로세스 diauxic 변화를 칭했다. 세포는 G 0 체포를 입력하기 전에 약 48 시간 이후 diauxic 단계에서 천천히 분리를 계속합니다. 세포의 대사 속도는 하루에 5-6 (매일 0 접종 일입니다)까지 높은 남아 있습니다. 시간이 지남에 따라 세포 생존 능력은 G 0 체포 및 양식 풍부한 YPED 접시에 식민지를 종료할 수 있습니다 이틀 샘플 날짜순으로 노화 세포의 비율,에 의해 액세스할 수 있습니다.
1. 액체 문화 효모 연대기 수명 (CLS)
- 1 ML 합성 전체 포도당 매체 (SDC, 표 1)에 하나의 식민지를 예방하고 30 (220 RPM) 잡고 밤새 품어 ° C. 독립 식민지에서 세 inoculums는 생물 학적 복제본을 제공하기 위해 각 변형에 대한 준비를해야합니다.
- OD 신선한 SDC 매체 (보통 10 ML)에 야간 문화를 희석 = 0.05-0.1 (~ 1:100 희석)와 30 (220 RPM) 잡고 품어 ° C. 이 시점은 연대기 노화의 일 0으로 간주됩니다. 적절한 통기 수 있도록 문화 / 술병 볼륨 (10 ML의 50 ML의 문화, 또는 이상 / 대형 실험 125 ML 25 ML 문화에 대한)의 1시 5분 비율을 유지합니다.
- 3 일부터 시작, 술병에서 10 μl 2 aliquots 제거 YEPD (1 % 효모 추출물, 2퍼센트 bacto 펩톤, 2 %의 덱스 트로 오스에 autoclaved 물, 10 μl 희석 문화 (즉, 10 4 -10) 10,000 번 희석 2 %의 한천) 접시, 그리고 연합 (CFU)를 형성 식민지가 계산되기 전에 48~72시간 30 ° C에서 알을 품다.
- 3 일 CFU는 100 % 생존 간주됩니다. 이후 일 노령화 문화의 희석 요인은 CFU 분석에서 ~ 20-100 식민지 (예, 10 4 -10, 10 4 -30, 10 세 -10 등)을 보장하기 위해 적절하게 조정해야합니다. DBY746 배경으로 야생 타입 세포 들어, CLS 하루 11 약 1 % 생존에 도달합니다.
현장 생존 분석에의 변형은 다음과 같습니다 :
- 포도당 제한으로 칼로리 제한 (CR). 포도당 제한 SC 매체에서 밤새 문화 희석 (예 : 대신 표준 2 % 포도당 0.5 또는 0.05 %)를 일반적으로 일 3 낮은 인구 포화 밀도로 연결하지만, 훨씬 수명 12 (10 % 생존) 의미와 최대한의 확장.
- 극단적인 CR / 기아 들어, (물 동일한 볼륨에 resuspend 세포 3 번 반복, 5 분 2,500 RPM에 다운 스핀) autoclaved 물 3 일 정지 위상 문화를 (보통 위의 3 단계에서 10 ML) 씻는다. 물에 Incubationof 세포는 효모는 야생에서 발생할 수있는 기아 상태를 모방한 것이었 지요. 이틀 후, 고령화 문화 autoclaved 물로 세탁하고 lysed 죽은 세포에서 풀려나는 모든 영양소를 제거하는 물 같은 볼륨에서 resuspended해야합니다. 위에 설명된대로 노화 문화를 샘플링하여 생존 분석을 수행합니다. 이 기아 상태는 야생 유형 DBY746 스트레인 12 건 CLS의 거의 두 배로 증가시킨 것입니다.
2. 원위치 생존 분석에서
액체 문화에서 생존 세포의 작은 파편은 세포주기를 다시 입력하고 남은 영양분이나 매체 죽은 세포를 lysed 그 발표 양식을 활용하여 성장 수 표현형는 regrowth를 칭했다 / 13 헐떡이고. 우리는 regrowth / 문제 허걱를 우회하기 위해 DBY746 변형 (trp1)의 auxotrophy을 활용 또한 효모에 대한 다양한 외부 영양분이나 자극의 지속적인 노출이나 박탈의 효과의 테스트를 허용 가능성 - 온 - 어 - 플레이트 시스템을 개발 CLS 11. 현장 생존 분석에서 이것은 세포가 지속적으로 수명 분석 기간 동안 풍부한 영양분에 노출되는 등 replicative 수명 모델을 모방한 것이었 지요.
- 1 ML 합성 전체 포도당 매체 (SDC)에 하나의 식민지를 예방하고 30 (220 RPM) 잡고 밤새 품어 ° C. 독립 식민지에서 최소한 세 inoculums는 생물 학적 복제본을 제공하기 위해 각 변형에 대한 준비를해야합니다.
- 문화 ~ 10 8 셀 / ML (OD 600 = ~ 10)로 성장하자, 100-200 cell/10 μl (보통 10 4 배 희석) 1000 cells/10 μl (에 culturewith autoclaved 물을 희석 10 3 배 희석).
- 하나 트립토판 중퇴 SDC 플레이트 플레이트에 희석 문화의 10-30 μl 두 aliquots합니다. 에R 각 변형은 8-20 접시 세트를 준비하고 도금 밀도에 따라 표시 (예, 10 4 배 희석, 판 10 μl 또는 10 4 -10, 10 4 -30, 10 세 -10, 10 세 -30 등), 어떤 10-100 식민지가 노화하는 동안 감소 생존의 기대에 포함 될 수 있도록.
- 수명 분석 기간 동안 30 ° C에서 설정 번호판을 품어.
- 도금의 날짜와 후 매 2 일, 한 판하고 드롭 현명한를 제거 가능한 세포가 성장할 수 있도록 0.5 ML 트립토판 (2 MG / ML)을 추가합니다. 추가 48-72시간 30 ° C에서 번호판을 품어. 트립토판 추가 당일 생존을위한 CFU를 계산합니다. 도금 당일 CFU는 100 % 생존 간주됩니다.
현장 생존 분석에의 변형은 다음과 같습니다 :
- 한천 플레이트에 대한 연령 전지 (극도의 기아 상태). 추가 1 ML 2X의 성장과 CFU 카운트 14 수 있도록 후속 일 대신 트립토판의 YPED.
- 다양한 탄소 소스, 포도당의 농도 예 : 다양한 (포도당 제한으로 칼로리 제한), 에탄올과 같은 다양한 탄소 소스, 글리세롤, 초산 14 트립토판 합성 중퇴 완전한 매체 접시에 나이 세포. 성장과 CFU 카운트를 허용 1 ML 포도당 / 트립토판 용액 (20 % 포도당과 1mg/ml 트립토판)을 추가합니다.
- 같은 질소와 같은 다른 영양소 조작.
3. 연대기 노화 동안의 DNA 손상과 돌연변이의 빈도
Canavanine 저항 (CAN R) 및 can1 시퀀싱
자연 돌연변이 빈도는 날짜순으로 고령화 사회에서는 canavanine 저항 (CAN R)의 빈도를 측정하여 평가할 수 있습니다. 플라즈마 아르기닌 permease를 인코딩 CAN1 (YEL063) 유전자,에 돌연변이 다른 시간 지점에서 수집된 아르기닌 아날로그 L - canavanine.Can R 식민지에 강한 세포도 게놈 DNA와 CAN1의 후속 시퀀싱의 추출을 위해 저장할 수 있습니다 렌더링 돌연변이 스펙트럼 데이터 (돌연변이의 서베이와 SoftGenetics) 제공할 수있는 유전자.
자료 대체 (TRP + reversions)
trp1 - 289과 함께 계통 TRP1 코딩 순서 호박 변이 (C403T)를 포함하고 있습니다. TRP + 복귀 15 trp1 - 289의 주파수 측정은 효모 연대기 노화 동안 기본 대체 속도의 추정 수 있습니다.
프레임 시프트 돌연변이
LYS - 변형 EH150은 (마타, lys2ΔBglII, trp1 - Δ, his3 - Δ200, ura3 - 52, ade2 - 1o) LYS2 유전자의 Bgl II 제한 효소 사이트를 만들려면 4 세포핵을 삽입하여 만들어진 lys2ΔBgl II의 돌연변이 항구 . 소형 삽입 / 삭제 돌연변이 16-17로 되돌릴 수있는 라이신에 대한 auxotrophy에서 열린 독서 프레임 결과에 결과 4 교대.
총 염색체 rearrangements (GCRs)
총 염색체 rearrangements (GCRs)를 감지하기 위해, 우리는있는 HXT13 (YEL069)이, 매우 중복 hexose 수송을 인코딩, URA3 카세트 18에 의해 중단되었다, 돌연변이 긴장을 생성. HXT13는 염색체 V. 돌연변이에 CAN1에 telomeric 7.5 킬로바이트에 위치해 있습니다 CAN1 및 URA3 유전자 모두에서 각각, L - canavanine 5 - fluoroorotic 초산 (5FOA)로 세포의 저항을 렌더링합니다. 수 R 5FOA R 주파수의 두 유전자 분석에서 발생하는 포인트 변이의 낮은 빈도를 고려하면 GCRs 두 유전자의 손실에 결과의 평가를 제공합니다.
동종 및 homeologous 재조합
동종 거꾸로 반복 (IRS) (pSR406 백퍼센트 중 하나를 수행 : 연대기 나이 중에 동종의 수준 (100 %) 및 homeologous 재조합 (91 %)를 모니터링하기 위해, 우리는 선형의 plasmids (인트론 - IR - URA3 HIS3)이되는 돌연변이를 생성 ) 또는 HIS3 현장 19 국세청 homeologous 91% (pSR407). 국세청 사이의 재조합이 기능 His3 단백질의 표현이 가능합니다.
- 정상적인 생존 분석 (위에서 설명한 것처럼)에 병렬로, 노화 문화 세포의 적절한 금액을 제거
- 수 R 변이에 대해, ~ 2x10 7 세포 (3 일 문화 200 μl)로 시작;
- TRP + 복귀를 위해, ~ 10 8 셀 (3 일 문화의 500-1000 μl)로 시작;
- LYS + 프레임 시프트 돌연변이에 대한 ~ 10 8 셀 (3 일 문화의 500-1000 μl)로 시작;
- GCRs 들어, 2 - 3x10 8 셀 (3 일 문화로부터 2-3 ML)로 시작;
- 동종 및 homeologous 재조합을위한, & 물결표 시작; 5x10 7 세포 (3 일 문화의 200-500 μl);
- 펠렛 벤치 - 최고 원심 기계 (5 분 6000 RPM)와 세포.
- 다시 한 ML autoclaved 물, 펠릿 세포에서 세포를 Resuspend.
- 물 100 μl에 Resuspend 세포 펠릿. 플레이트 세포,
- 에 대한 아르기닌 - 중퇴 합성 전체 중간 접시에 R 변이 (SDC - ARG, 60 μg / ML L - canavanine 황산과 보충)은 수있다;
- TRP + 복귀를 위해, 트립토판 - 중퇴의 접시에 (SDC - TRP);
- LYS + 프레임 시프트 돌연변이에 대해, 라이신 - 중퇴의 접시에 (SDC - LYS);
- GCRs 들어, 아르기닌 - 중퇴의 접시에 (SDC - ARG) 5FOA (1 MG / ML)과 L - canavanine 황산 (60 μg / ML)로 보충;
- 동종 및 homeologous 재조합을위한, 히스티딘 - 중퇴 플레이트에서 갈락토 오스 (2 %)과 보완.
- 30 3~4일 '부화 후 CFUs 세어 ° C. 돌연변이의 빈도가 가능한 세포의 개수 표준입니다.
로 보완 현장 생존 분석에서 연령 종속 TRP + 복귀, LYS + 프레임 시프트 돌연변이, 재조합, 또는 R 수도 접시에 이상 세포에서 공부하실 수 있습니다.
- TRP -, LYS - 그의 - 중퇴, 또는 L - canavanine 합성 전체 중간 플레이트 (위에서 설명한 것처럼)에 플레이트 세포 (~ 10 8 셀 / 플레이트).
- 이틀 (또는 관심의 시점에서) 새로 신흥 식민지 점수.
- 돌연변이 주파수는 특정 일의 가능한 세포의 총 개수에 새로 신흥 식민지를 정상화하여 추정된다.
4. Translesion 합성 (TLS)
연령에 의존 돌연변이의 빈도 증가 증가 macromolecule 손상, 감소 세포 보호 / 복구를 포함하고, 노화 중 잘못된 DNA 수리 (예 : Polζ 종속 translesion 합성, TLS 등) 증가 수 있습니다. 예를 들어, 긴 sch9 Δ의 뮤턴트 SOD2의 강화된 표현을 전시하고, 오류가 발생하기 쉬운 DNA 수리 효소 Rev1 20 표현을 감소. 여기 우리는 체외에서 TLS를 평가하기 위해 손상된 DNA 템플릿 및 전체 핵 추출물을 결합 분석을 설명합니다.
- 왕 외에 의해 설명된대로 핵 추출물 준비 21;. BCA 분석 (피어스)에 의해 단백질 농도를 계량.
- TLS 버퍼 (20 MM의 HEPES, 7 MM MgCl 2, 1 MM DTT, 25 MM NaCl, 산도 7.8), 200 μMdNTPs 100 nm의를 포함하는 50 μl (최종 볼륨) 반응에 핵 추출물의 0, 5, 10 또는 20 μg 추가 5' - 32 P - 라벨 12 - 메르 입문서이자 DNA의 손상 (5' - TCG ATA CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC를 포함하는 48 메르 템플릿 annealed (5' - CGA TAC TGG GGA - 3 ') ACG GTA CCA TCC TCG - 3 '는있는 X)는, abasic 사이트, 8 - 옥소 - G 등 손상된 사이트, 예를 들어 있습니다.
- 30 혼합물을 품어 ° C 30 분, 2.5 μl EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (20 ㎜)과 proteinase K (10 MG / ML) 2 μl의 추가와 반응을 종료할 수 있습니다.
- 페놀 추출 및 에탄올 강우량과 DNA 정화.
- 겔로드 버퍼의 50 μl에 Resuspend의 DNA (98 % 포름 아미드, 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 그리고 염료).
- 19 % polyacrylamide의 젤에 translesion 합성 제품을 해결합니다.
- phosphorimaging (그림 1)를 사용하여 TLS를 계량.
5. 대표 결과
우리는 일반적으로 표준 액체 CLS 분석에 100 % 생존과 같은 일 3 CFU 카운트를 사용합니다. 이후 일 비율 생존는 의미 (50 % 생존)를 계산하기 위해 장착 및 최대 (10 % 생존) 생활은 12에 걸쳐 수 있습니다. 현장 생존 분석에서 얻은 수명 결과는 일반적으로 액체 CLS 분석을 사용하는 사람과 일치이지만,이 부분에서 세포가 지속적으로 영양분에 노출되어있다는 사실로 인해 평균 수명을 감소. 포도당의 존재가 세포 보호 활동 등 Msn2 / 4 Gis1 12 스트레스 응답 전사 인자의 감소로 나타났다 transactivation 억제.
연령 의존 돌연변이의 빈도가 크게 변형 배경, 유전자 조작, 문화 상태, 연령에 따라 다릅니다. 표 2는 야생 타입 변형 (DBY746)에서 얻은 전형적인 결과를 보여줍니다.
| 구성 요소 | G / L |
|---|---|
| D - 글루코오스 | 20 |
| 암모늄 황산 | 5 |
| 질소베이스 (-AS/-AA) | 1.8 |
| NaH2PO4 | 1.4 |
| MG / L | |
| 아데닌 | 80 |
| L - 아르기닌 | 40 |
| L - Aspartic 산 | 100 |
| L - 글루탐산 | 100 |
| L - 히스티딘 | 80 |
| L - 이소 류신 | 60 |
| L - 류신 | 120 |
| L - 라이신 | 60 |
| L - 메티오닌 | 80 |
| L - 페닐알라닌 | 60 |
| L - 세린 | 400 |
| L - 트레오닌 | 200 |
| L - 트립토판 | 80 |
| L - 티로신 | 40 |
| L - 발린 | 150 |
| 유라실 | 80 |
표 1. 합성 전체 포도당 매체, SDC (NaOH로 pH를 6.0으로 조정). 히스티딘의 4 배 초과, 류신, 트립토판, 그리고 유라실는 DBY746 변형의 auxotrophy을 보상하기 위해 포함되어 있습니다.
| 3 일 (± SEM을 의미) | 최대 (노화 중) | |
|---|---|---|
| R 수 | 1.76 ± 0.12 X10 -6 | X10 -6 6-8 |
| TRP +의 복귀 | 6.60 ± 1.70 X10 -8 | X10 -6 1.60 |
| LYS + 프레임 시프트 돌연변이 | 3.00 ± 0.78 X10 -8 | X10 -6 0.70 |
| GCRs | 0.62 ± 0.10 X10 -8 | X10 -6 0.30 |
| 상동 재조합 | 5.55 ± 2.74 X10 -6 | X10 -6 27.00 |
| Homeologous 재조합 | 0.12 ± 0.04 X10 -6 | X10 -6 0.48 |
표 2. 연대기 나이 중에 야생 유형 세포의 일반적인 돌연변이 주파수 (DBY746).
그림 1. translesion 합성 (TLS) 20 결과. 삼일 된 고정 야생 타입 단계 (DBY746)와 sch9 Δ 돌연변이 세포의 핵 추출물은 30 ° C. 30 분 손상 또는 abasic 사이트가 들어있는 DNA의 템플릿 incubated되었습니다 TLS 제품은 고체 (손상되지 않은 템플릿) 또는 점선 (손상된 템플릿) 라인으로 표시됩니다. sch9 Δ의 돌연변이에서 핵 추출물에서 관찰 더 translesion 합성이 없었다. 무료 primers는 열려있는 화살표로 표시됩니다.
Discussion
액체 노화 문화 언젠가 regrowth / CLS 분석을 복잡 허걱 표현형 13, 전시. 인구의 이상 90-99%이 경쟁력을 잃게되면 Regrowth은 일반적으로 발생합니다. 이 표현형은 종종 증가 산화 스트레스 및 / 또는 세포의 감소 방지와 관련된 것입니다. 예를 들어,이 표현형의 빈도가 더 cytosolic 초과 산화물의 dismutase를 부족한 세포에 두 배로 증가보다 크게 긴 돌연변이의 감소 (예 : sch9 Δ 또는 ras2 Δ)이나 돌연변이 overexpressing의 초과 산화물은 22 dismutases. 실제로, 우리는 연대기 노화 동안 높은 사망률 단계에서 3 연속 samplings을위한 생존의 가능성이나 안정화 증가로 regrowth을 정의합니다.
다른 DNA 변이의 연령 종속 주파수가 크게 변형 배경, 유전자 조작, 문화 조건뿐만 아니라, regrowth / 허걱 매우 낮은 생존에 따라 다릅니다. 사전 실험 등 performingthe 전체 규모 수명 분석하기 전에 돌연변이 주파수 범위를 결정하기 위해 돌연변이의 assays 다양한 도금 밀도 의미와 최대 생존과 같은 시간 지점에서 수행되어야합니다. 야생 유형 변형은 항상 어떤 치료 또는 유전자 돌연변이에 병렬로 수명이나 돌연변이의 빈도 연구에 포함되어야하는 상호 실험 - 유사를 설명할 수 수있을 것이다. 여러 생물 학적 복제가 연구에 포함되어야하며, 액체 모두와 현장 생존 / 돌연변이 assays에 결과를 확증하기 위해 실시한다.
대신 조합의 여러 assays을 사용 연령 의존 게놈의 불안정성의 프로 파일링 DNA 돌연변이 중 하나가 특정 유형에 초점을 특정 DNA 손상과 나이 종속 게놈의 불안정성에 기여하는 DNA 손상 복구 시스템 (들)에이 되거 수 있습니다. 예를 들어, 다른 DNA 변이의 사람에 비해 총 염색체 rearrangements (GCRs)에 상당한 증가, 효모 동안 비 동종 결국 elevationof 더블 스트랜드 휴식 및 / 또는 장해 가입 (NHEJ)을 제안 야생 유형 효모의 관찰 연대기 노화 (표 2). 야생 형 노화 효모에서 얻은 can1 돌연변이 스펙트럼은 (CAN1 유전자의 배열) 연대기 고령화 및 오류 발생하기 쉬운 DNA 수리하는 동안 산화 손상을 증가 제안, 반면에, 긴 sch9 Δ의 돌연변이에 더 적은 산화 DNA의 손상 및 많이 감소 오류가 발생하기 쉬운 translesion 합성 20을 관찰했다.
여기에서 설명한 방법은 더욱 연령 종속 게놈의 불안정성을 연구하기 위해 소비하실 수 있습니다. 예를 들어, 정지 및 비 정지 전지는 알렌 외 의해 설명되어있는 밀도 기울기 방법을 사용하여 효모 고정 상 문화에서 격리 수 있습니다. 23. 돌연변이의 assays 여기서 설명과 함께, 우리는 나이에 종속 변이의 많은 부분이 오히려 나누어, 손상되었거나 apoptotic 세포 20,24보다 정지 세포에서 발생보고있다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 plasmids과 효모 종자를 제공 S. 법석 로버트슨과 E. Heidenreich 감사, P. 팜과와 MF 굿맨 도움이 withthe TLS 분석하십시오. 이 작품은 노화 연구 부여에 대한 미국 연맹에 의해 그리고 NIH AG20642, AG025135에 의해 부분적으로 지원되었다.
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