Summary
Hier beschreiben wir eine Reihe von DNA Mutationsassays, dass mit der Hefe chronologische Lebensspanne Modell, um die Gene / Wege, oder regeln dazu beitragen, genomische DNA Instabilität während des Alterns Studie kombiniert werden können.
Abstract
Studien mit dem Saccharomyces cerevisiae Alterung Modell haben Lebensspanne Regulationswege, teilweise in höheren Eukaryonten 1-2 sind konserviert aufgedeckt. Die Einfachheit und Leistungsfähigkeit der Hefe Alterung Modell kann auch untersucht werden, um DNA-Schäden und Genom-Wartung sowie ihre Beiträge zu Krankheiten während der Alterung zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein System zur Alters-abhängigen DNA-Mutationen, einschließlich Basensubstitutionen, frame-shift-Mutationen, grobe chromosomale Umlagerungen und homologen / homeologous Rekombination, sowie nukleare DNA-Reparatur-Aktivität durch die Kombination der Hefe chronologische Lebensspanne mit einfachen DNA-Studie Schäden und Mutationsassays. Die hier beschriebenen Methoden sollte die Identifizierung von Genen / Wege, die genomische Instabilität und die Mechanismen, die alters-abhängigen DNA-Mutationen und Krebs in Säugern zugrunde liegen, zu regulieren.
Protocol
Zwei Lebensdauer Modelle eingesetzt, um Studie Altern in S. cerevisiae: RLS und CLS. Die replikativen (angehende) Lebensdauer (RLS) ist die Beobachtung, dass Hefe Mutter-Zellen eine endliche Anzahl von Divisionen 3-6 unterziehen basiert. Wir werden uns auf die chronologische Lebensspanne (CLS), ein Modell, das auf die chronologische Überleben der nicht-teilenden Hefe in der Kultur oder auf Platten 7-11 Basis zu konzentrieren. Wildtyp-Hefe wächst exponentiell für 10-12 Stunden in synthetischer Dextrose komplett (DEZA) Medium . Wenn Blutzuckerspiegel senkt, Hefe-Switches aus der Fermentation, um die Atmung, bezeichnet einen Prozess diauxisches verschieben. Cells weiterhin langsam teilen während der post-diauxisches Phase für rund 48 Stunden vor der Einfahrt G 0 zu verhaften. Die metabolische Rate der Zellen bleibt hoch bis zum Tag 5-6 (Tag 0 ist die Impfung Tag). Die Lebensfähigkeit der Zellen im Laufe der Zeit kann durch den Prozentsatz der chronologisch alternden Zellen abgetastet alle zwei Tage, die G 0 Verhaftung und bilden Kolonien, die auf reiche YPED Platten Ausfahrt zugegriffen werden kann.
1. Hefe chronologische Lebensspanne (CLS) in flüssiger Kultur
- Impfen einer einzigen Kolonie in 1 ml synthetischen vollständigen Glucose-Medium (SDC, Tabelle 1) beimpft und über Nacht unter Schütteln (220 rpm) bei 30 ° C. Drei Impfkulturen von unabhängigen Kolonien sollten für jeden Stamm der biologischen Replikate bieten vorbereitet werden.
- Verdünnen Sie die Übernacht-Kultur in frische DEZA Medium (meist 10 ml) bis OD = 0,05-0,1 (~ 1:100 Verdünnung) und inkubieren unter Schütteln (220 rpm) bei 30 ° C. Dieser Zeitpunkt gilt als Tag 0 der chronologischen Alterung. Pflegen Sie ein 1:5-Verhältnis von Kultur / Flasche Volumen (10 ml Kultur in 50 ml, oder auch für längere / große Experimente 25 ml Kultur in 125 ml), um eine ordnungsgemäße Belüftung zu gewährleisten.
- Ab Tag 3, zu entfernen 2 Aliquots von 10 ul aus dem Kolben, verdünnen 10.000 Mal in autoklaviert Wasser, 10 ul verdünnt Kultur (dh 10 4 -10) auf YEPD (1% Hefeextrakt, 2% Bacto Pepton, 2% Dextrose , 2% Agar) Platten, und inkubieren Sie bei 30 ° C für 48-72 Stunden vor dem Kolonie-bildenden vereinen (CFU) gezählt wird.
- Tag 3 CFU gilt als 100% ige Überlebensrate. Verdünnungsfaktoren des Alterns Kultur in den folgenden Tagen sollte entsprechend angepasst werden, um ~ 20-100 Kolonien in der CFU-Assay (zB 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, etc.) zu gewährleisten. Für Wildtyp-Zellen in der DBY746 Hintergrund erreicht der CLS 1% Überlebensrate um Tag 11.
Variationen in situ Lebensfähigkeit Assay sind:
- Kalorienreduktion (CR) von Glukose Einschränkung. Verdünnung der Übernacht-Kultur in Glukose begrenzt SC Medium (z. B. 0,5 oder 0,05% statt der üblichen 2% Glucose) in der Regel zu niedrigeren Bevölkerung Sättigungsdichte am Tag 3 führen, aber viel längeren mittleren und maximalen (10% Überlebensrate) Lebensdauer 12.
- Für extreme CR / Hunger, waschen Tag 3 stationäre Phase Kultur (in der Regel 10 ml, wie in Schritt 3 oben) mit autoklaviertem Wasser (die Zellen in dem gleichen Volumen Wasser und Spin-Down bei 2500 rpm für 5 min, 3 Mal wiederholen). Incubationof Zellen in Wasser ahmt die Hungersnot der Bedingung, dass Hefe kann in freier Wildbahn zu begegnen. Alle zwei Tage später sollte alternden Kultur mit autoklaviertem Wasser gewaschen und erneut in dem gleichen Volumen Wasser, um alle Nährstoffe aus lysierten toten Zellen freigesetzt zu entfernen. Führen Sie die Lebensfähigkeit Assay durch Abtasten des alternden Kultur wie oben beschrieben. Dieser Hunger Bedingung wird auf fast eine Verdopplung der mittleren CLS im Wildtyp DBY746 Stamm 12 geführt.
2. In situ Lebensfähigkeit Test
In den flüssigen Kultur, ein kleiner Bruchteil der überlebenden Zellen kann erneut eingegeben werden den Zellzyklus und wachsen Nutzung verbleibenden Nährstoffe oder Freigelassenen Form lysiert toten Zellen in das Medium, ein Phänotyp Nachwachsen bezeichnet / keuchend 13. Wir entwickelten eine Lebensfähigkeit-on-a-Plate-System, dass die Auxotrophie des DBY746 Stamm (trp1) nutzt, um das Nachwachsen / keuchend Problem zu umgehen und erlauben auch die Prüfung der Wirkung von konstanten Exposition oder der Entzug der verschiedenen externen Nährstoffen oder Reize auf Hefe CLS 11. Diese in situ Lebensfähigkeit Assay auch imitiert die replikativen Lebensspanne Modell, so dass Zellen werden ständig reichlich Nährstoffe für die Dauer der Lebensspanne Analyse ausgesetzt.
- Impfen einer einzigen Kolonie in 1 ml synthetischen vollständigen Glucose-Medium (DEZA) beimpft und über Nacht unter Schütteln (220 rpm) bei 30 ° C. Mindestens drei Impfkulturen von unabhängigen Kolonien sollten für jeden Stamm der biologischen Replikate bieten vorbereitet werden.
- Lassen Sie die Kultur auf ~ 10 8 Zellen / ml (OD 600 = ~ 10) wachsen, verdünnen culturewith autoklaviertem Wasser auf 100-200 cell/10 ul (meist 10 4-fach verdünnt) und 1.000 Zellen/10 ul (10 3 -fachen Verdünnung).
- Platte zwei Aliquots von 10-30 ul der verdünnten Kultur auf einen Tryptophan-Dropout DEZA Platte. Fürr jeden Stamm, bereiten eine Reihe von 8 bis 20 Platten und beschriftet nach Plattierungsdichte (z. B. 10 4-fach verdünnt, Platte 10 ul oder 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, 10 3 -30 , etc.), die sicherstellen, 10-100 Kolonien in Erwartung einer verringerten Lebensfähigkeit kann während des Alterns gezählt werden.
- Die Platte bei 30 ° C für die Dauer der Lebensspanne Analyse.
- Am Tag der Beschichtung und alle 2 Tage später, entfernen Sie eine Platte und tropfenweise mit 0,5 ml Tryptophan (2 mg / ml), damit lebensfähige Zellen zu wachsen. Die Platte bei 30 ° C für weitere 48-72 Stunden. Zählen Sie die KBE Lebensfähigkeit am Tag der Tryptophan hinaus. Die CFU am Tag der Beschichtung wird als 100% ige Überlebensrate.
Variationen in situ Lebensfähigkeit Assay sind:
- Age-Zellen auf Agarplatten (extreme Hunger-Bedingung). 1 ml 2x YPED statt Tryptophan an den nachfolgenden Tagen zu Wachstum und CFU zählen 14 zu ermöglichen.
- Age-Zellen auf Platten mit dem Tryptophan-Dropout synthetischen Vollmedium mit verschiedenen Kohlenstoff-Quellen, zB verschiedenen Konzentrationen von Glukose (Kalorienreduktion durch Glukose Begrenzung), verschiedene Kohlenstoffquellen wie Ethanol, Glycerin, Essigsäure 14. 1 ml Glucose / Tryptophan-Lösung (20% Glucose und 1mg/ml Tryptophan), um Wachstum und CFU zählen können.
- Andere Nährstoffe Manipulation, wie zum Beispiel Stickstoff.
3. DNA-Schäden und Mutationen Frequenz bei chronologischer Alterung
Canavanin Widerstand (Can r) und can1 Sequenzierung
Spontanmutationshäufigkeit kann durch Messung der Frequenz von Canavanin Widerstand (Can r) in chronologischer Alterung Kulturen ausgewertet werden. Mutationen in den CAN1 (YEL063) Gen, das die Plasma-Arginin-Permease kodiert, render Zellen resistent gegenüber der Arginin-Analogon L-canavanine.Can r Kolonien zu verschiedenen Zeitpunkten erhoben werden, auch kann für die Extraktion von genomischer DNA und anschließende Sequenzierung des CAN1 gespeichert werden Gen, das Mutationsspektrum Daten (mit Mutation Surveyor, SoftGenetics) bieten kann.
Basensubstitutionen (Trp + Rückfälle)
Stämme mit trp1-289 enthalten eine Amber-Mutation (C403T) im TRP1-codierende Sequenz. Messung der Frequenz von TRP1-289 zu Trp +-Reversion-15 ermöglicht die Abschätzung der Basenaustausch Rate während Hefe chronologischer Alterung.
Frame-shift-Mutationen
Die Lys - Stamm EH150 (Mata, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200, ura3-52, ade2-1o) birgt ein lys2ΔBgl II Mutation, die durch Einsetzen 4 Nukleotide eine Bgl II Restriktionsenzymstelle in der LYS2 Gen erstellen gebaut wurde . Die daraus resultierenden vier Verschiebung in den offenen Leserahmen Ergebnisse in Auxotrophie für Lysin, die durch kleine Einfügen / Löschen Mutationen 16-17 rückgängig gemacht werden kann.
Gross chromosomale Umlagerungen (GCRs)
Zur Erkennung grober chromosomale Umlagerungen (GCRs) erzielten wir einen mutierten Stamm, in dem HXT13 (YEL069), kodierend für eine hoch redundante Hexose-Transporter wurde von einem URA3 Kassette 18 unterbrochen. HXT13 liegt 7,5 kb Telomer zu CAN1 auf Chromosom V. Mutationen in beiden CAN1 und URA3-Gene machen Zellen Resistenz gegen L-Canavanin und 5-Fluororotsäure (5FOA) bzw.. Angesichts der niedrigen Frequenz von Punktmutationen, die in beide Gene, die Analyse der Can r 5FOA r Frequenz auftreten liefert eine Schätzung der GCRs dazu führen, dass der Verlust der beiden Gene.
Homologe Rekombination und homeologous
Zur Überwachung der Ebene der homologen (100%) und homeologous Rekombination (91%) bei chronologischer Alterung erzielten wir Mutanten, in denen linearisierten Plasmide (HIS3: Intron-IR-URA3), der entweder zu 100% homologen inverted repeats (IRs) (pSR406 ) oder 91% homeologous IRs (pSR407) am HIS3-Locus 19. Rekombination zwischen der IRS ermöglicht die Expression von funktionellen His3 Protein.
- Parallel zur normalen Lebensfähigkeit Assay (wie oben beschrieben), zu entfernen eine entsprechende Menge an Zellen aus der Alterung der Kultur,
- Can r Mutation, die mit ~ 2x10 7 Zellen (200 ul von Tag 3 Kultur) zu beginnen;
- für Trp +-Reversion, mit ~ 10 8 Zellen (500-1000 ul von Tag 3 Kultur) zu beginnen;
- für Lys + frame-shift Mutation, die mit ~ 10 8 Zellen (500-1000 ul von Tag 3 Kultur) zu beginnen;
- für GCRs, mit 2-3x10 8 Zellen (2-3 ml Tag 3 Kultur) zu beginnen;
- für die homologe Rekombination und homeologous, mit & Tilde beginnen; 5x10 7 Zellen (200-500 ul von Tag 3 Kultur);
- Pellet die Zellen mit Tischzentrifuge Maschine (6000 rpm für 5 min).
- Die Zellen in 1 ml autoklaviertem Wasser und Pellet die Zellen wieder.
- Resuspendieren Zellpellet in 100 l Wasser. Platte Zellen,
- Can r Mutation, auf Arginin-Dropout-synthetischen Vollmedium-Platten (SDC-Arg, ergänzt mit 60 ug / ml L-Canavanin Sulfat);
- für Trp + Reversion auf Tryptophan-Dropout-Platten (SDC-Trp);
- für Lys + frame-shift Mutation, auf Lysin-Dropout-Platten (SDC-Lys);
- für GCRs, auf Arginin-Dropout-Platten (SDC-Arg) mit 5FOA (1 mg / ml) und L-Canavanin Sulfat (60 pg / ml) ergänzt;
- für die homologe Rekombination und homeologous auf Histidin-Dropout-Platten mit Galaktose (2%) ergänzt.
- Graf KBE nach 3-4 Tagen Inkubation bei 30 ° C. Die Mutationsrate ist es, die Anzahl der lebensfähigen Zellen normalisiert.
Ergänzend zu den in situ Lebensfähigkeit Assay, altersabhängige Trp +-Reversion, Lys + frame-shift Mutation, Rekombination, oder r können auch in den Zellen auf der Platte im Alter untersucht werden.
- Platte Zellen (~ 10 8 Zellen / Platte) auf Trp-, Lys-, His-Dropout-oder L-Canavanin synthetischen Vollmedium-Platten (wie oben beschrieben).
- Alle zwei Tage (oder zum Zeitpunkt Point of Interest), erzielt das neu entstehende Kolonien.
- Mutation Frequenz wird durch die Normalisierung der neu entstehenden Kolonien an der Gesamtzahl der lebenden Zellen des spezifischen Tag geschätzt.
4. Translesion Synthese (TLS)
Die altersabhängige Mutationsfrequenz erhöhen können zu einem erhöhten Makromolekül Schäden, verminderte zelluläre Schutz / Reparatur und erhöhte fehlerhafte DNA-Reparatur (wie Polζ-abhängige translesion Synthese, TLS) während des Alterns. Zum Beispiel zeigen die langlebigen sch9 Δ Mutanten erhöhte Expression von SOD2 und verminderte Expression der fehlerhaften DNA-Reparatur-Enzym Rev1 20. Hier beschreiben wir einen Assay kombiniert geschädigte DNA-Template und ganze Kernextrakt die TLS in vitro zu evaluieren.
- Bereiten Kernextrakt wie von Wang et al 21;. Quantifizierung der Protein-Konzentration von BCA-Assay (Pierce).
- Fügen Sie 0, 5, 10 oder 20 ug Kernextrakten zu 50 ul (Endvolumen) Reaktionen, die TLS-Puffer (20 mM HEPES, 7 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 7,8), 200 μMdNTPs und 100 nM 5'-32 P-markierten 12-mer-Primer (5'-TGG CGA TAC GGA-3 ') geglüht, um eine 48-mer Vorlage mit DNA-Schäden von Interesse (5'-TCG ATA CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC ACG TCC GTA CCA TCG-3 ', in denen X die beschädigte Stelle, zB Basenlücke, 8-oxo-G, etc.).
- Inkubieren Sie die Mischung bei 30 ° C für 30 min, kündigen die Reaktion mit der Zugabe von 2,5 ul EDTA (20 mM) und 2 ul Proteinase K (10 mg / mL).
- Purify DNA mit Phenol-Extraktion und Ethanolfällung.
- Resuspendieren DNA in 50 ul Gelladepuffer (98% Formamid, 20 mM EDTA und Farbstoff).
- Beheben Sie den translesion Syntheseprodukte auf 19% Polyacrylamidgelen.
- Quantifizierung der TLS mit Phosphorimaging (Abbildung 1).
5. Repräsentative Ergebnisse
Wir in der Regel verwendet die KBE-Zählungen am Tag 3 zu 100 Prozent das Überleben in der Standard-Flüssigkeit CLS-Analyse. Der Anteil Überleben in den folgenden Tagen kann angebaut werden, die mittlere (50% Überleben) zu berechnen und die maximale (10% Überlebensrate) Lebensdauer 12. Lebensdauer ergibt sich aus der in situ Lebensfähigkeit Assay erhaltenen sind in der Regel im Einklang mit den mit der flüssigen CLS-Test, aber mit reduzierten die mittlere Lebensdauer, die zum Teil auf die Tatsache, dass die Zellen ständig, um Nährstoffe ausgesetzt ist. Anwesenheit von Glukose hemmt die Aktivität der zellulären Schutz zeigte durch die verringerte Transaktivierung von Stress-Reaktion Transkriptionsfaktor wie MSN2 / 4 und Gis1 12.
Altersabhängige Mutationsfrequenz variiert stark je nach Stamm Hintergrund, Genmanipulationen, Kulturbedingungen und Alter. Tabelle 2 zeigt die typische Ergebnisse in den Wildtyp-Stamm (DBY746) erhalten.
| Komponente | g / L |
|---|---|
| D-Glucose | 20 |
| Ammoniumsulfat | 5 |
| Nitrogen Base (-AS/-AA) | 1,8 |
| NaH2PO4 | 1,4 |
| mg / L | |
| Adenin | 80 |
| L-Arginin | 40 |
| L-Asparaginsäure | 100 |
| L-Glutaminsäure | 100 |
| L-Histidin | 80 |
| L-Isoleucin | 60 |
| L-Leucin | 120 |
| L-Lysin | 60 |
| L-Methionin | 80 |
| L-Phenylalanin | 60 |
| L-Serin | 400 |
| L-Threonin | 200 |
| L-Tryptophan | 80 |
| L-Tyrosin | 40 |
| L-Valin | 150 |
| Uracil | 80 |
Tabelle 1. Synthetic komplette Glucose-Medium, SDC (auf pH 6,0 mit NaOH). 4-facher Überschuss an Histidin, sind Leucin, Tryptophan und Uracil enthalten, um die Auxotrophie des DBY746 Belastung zu kompensieren.
| Tag 3 (Mittelwert ± SEM) | Bis zu (während des Alterns) | |
|---|---|---|
| Kann r | 1,76 ± 0,12 x10 -6 | 6-8 x10 -6 |
| Trp +-Reversion | 6,60 ± 1,70 x10 -8 | 1,60 x10 -6 |
| Lys + frame-shift Mutation | 3,00 ± 0,78 x10 -8 | 0,70 x10 -6 |
| GCRs | 0,62 ± 0,10 x10 -8 | 0,30 x10 -6 |
| Homologe Rekombination | 5,55 ± 2,74 x10 -6 | 27,00 x10 -6 |
| Homeologous Rekombination | 0,12 ± 0,04 x10 -6 | 0,48 x10 -6 |
Tabelle 2. Typische Mutation Frequenzen von Wildtyp-Zellen (DBY746) bei chronologischer Alterung.
Abbildung 1. Ergebnis translesion Synthese (TLS) 20. Nuclear Auszüge aus 3 Tage alten stationären Phase Wildtyp (DBY746) und sch9 Δ mutierten Zellen wurden mit unbeschädigten oder Basenlücke-haltigen DNA-Templates für 30 min bei 30 ° C inkubiert TLS Produkte zeichnen sich durch solide (mit unbeschädigten Vorlage) oder gepunktete (mit beschädigten Vorlage) angedeutet. Es gab keine translesion Synthese in nuklearen Auszug aus sch9 Δ Mutanten beobachtet. Kostenlose Primer sind durch die offene Pfeil gekennzeichnet.
Discussion
Flüssige alternden Kulturen irgendwann weisen Nachwachsen / keuchend Phänotyp 13, die die CLS-Analyse erschwert. Nachwachsen der Regel tritt ein, wenn mehr als 90-99% der Bevölkerung Lebensfähigkeit verloren hat. Dieser Phänotyp ist häufig mit einem erhöhten oxidativen Stress und / oder verminderter Schutz in der Zelle verbunden sind. Zum Beispiel, die Frequenz dieser Phänotyp mehr als verdoppelt in Zellen ohne cytosolische Superoxiddismutase und reduziert in langlebigen Mutanten (zB sch9 Δ oder Ras2 Δ) oder Mutanten überexprimiert Superoxiddismutasen 22. In der Praxis definieren wir Nachwachsen wie eine Erhöhung der Rentabilität oder der Stabilisierung der Rentabilität für 3 aufeinander folgende Proben in der hohen Mortalität Phase bei chronologischer Alterung.
Altersabhängige Häufigkeit der verschiedenen DNA-Mutationen variieren stark je nach Stamm Hintergrund, Genmanipulationen, Kulturbedingungen, sowie das Nachwachsen / keuchend und äußerst geringe Überlebenschancen. Pre-Experimente sollten zu den Zeitpunkten, wie die mittleren und maximalen Überleben mit verschiedenen Beschichtungs-Dichte für Mutationsassays Mutation Frequenzbereich vor performingthe Endwert Lebensdauer Analyse zu bestimmen sein. Die Wildtyp-Stamm sollte immer in einer Lebensdauer oder Mutationsfrequenz Studie aufgenommen werden parallel zu einer Behandlung oder genetische Mutanten, so dass inter-Experiment-Variationen für gerechtfertigt werden kann. Mehrere biologische Replikate sollten in die Studie aufgenommen werden, und sowohl flüssiger als auch in situ Lebensfähigkeit / Mutationsassays sollte durchgeführt werden, zu bestätigen die Ergebnisse.
Statt sich auf eine bestimmte Art von DNA-Mutation, Profilierung der altersabhängigen genomische Instabilität mit mehreren Tests in Kombination, kann Licht auf spezifische DNA-Schäden und DNA-Schäden zu reparieren System (s), die altersabhängige genomische Instabilität beitragen zu vergießen. Zum Beispiel ist eine deutliche Steigerung des Brutto-chromosomale Umlagerungen (GCRs), im Vergleich zu denen anderer DNA-Mutationen, in Wildtyp-Hefe beobachtet, die auf eine elevationof Doppelstrangbruch und / oder eine Beeinträchtigung in nicht-homologen Ende (NHEJ) während der Hefe chronologischer Alterung (Tabelle 2). Die can1 Mutationsspektrum (Sequenzierung des CAN1-Gen) in den Wildtyp-Aging-Hefe gewonnen schlug eine Erhöhung der oxidativen Schäden bei chronologischer Alterung und fehleranfällige DNA-Reparatur; in der Erwägung, langlebige sch9 Δ Mutanten weniger oxidative DNA-Schäden und stark reduziert fehleranfällige translesion Synthese wurden 20 beobachtet.
Hier beschriebenen Methoden können weitere aufgewendet werden, um altersabhängige genomische Instabilität zu studieren. Zum Beispiel kann ruhig und nicht-ruhenden Zellen von Hefe stationären Phase Kulturen mit der Dichtegradienten-Methode von Allen et al isoliert werden. 23. Zusammen mit der Mutation beschriebenen Tests hier haben wir berichtet, dass ein großer Teil der altersabhängigen Mutationen von ruhenden Zellen, anstatt die Grenze, beschädigt oder apoptotischen Zellen 20,24 entsteht.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken S. Jinks Robertson und E. Heidenreich für die Bereitstellung von Plasmiden und Hefestämme; P. Pham und MF Goodman um Hilfe withthe TLS-Assay. Diese Arbeit wurde unterstützt, zum Teil von der American Federation für Alternsforschung zu gewähren und durch NIH AG20642, AG025135.
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