Summary
यहाँ हम डीएनए उत्परिवर्तन assays कि खमीर कालानुक्रमिक जीवन काल के लिए जीन / मार्ग है कि विनियमित या उम्र बढ़ने के दौरान जीनोमिक डीएनए अस्थिरता के लिए योगदान के अध्ययन के मॉडल के साथ जोड़ा जा सकता का एक सेट का वर्णन.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae बुढ़ापे मॉडल का उपयोग करते हुए अध्ययन जीवन काल नियामक मार्ग है कि आंशिक रूप से उच्च 1-2 eukaryotes में संरक्षित कर रहे हैं खुला है. सादगी और खमीर उम्र बढ़ने की मॉडल की शक्ति भी डीएनए की क्षति और जीनोम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रखरखाव उम्र बढ़ने के दौरान रोगों के लिए अपने योगदान के अध्ययन के लिए पता लगाया जा सकता है. यहाँ, हम एक प्रणाली का वर्णन उम्र पर निर्भर आधार substitutions, फ्रेम पारी म्यूटेशनों, सकल गुणसूत्र rearrangements, और मुताबिक़ / homeologous पुनर्संयोजन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सरल डीएनए के साथ खमीर कालानुक्रमिक जीवन काल के संयोजन द्वारा परमाणु डीएनए की मरम्मत गतिविधि सहित डीएनए उत्परिवर्तन का अध्ययन नुकसान और उत्परिवर्तन assays. यहाँ वर्णित विधियों कि जीनोमिक अस्थिरता और तंत्र है कि स्तनधारियों में उम्र पर निर्भर डीएनए म्यूटेशनों और कैंसर आबाद को विनियमित जीन / रास्ते की पहचान की सुविधा चाहिए.
Protocol
दो उम्र मॉडल एस में उम्र बढ़ने अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है cerevisiae: आरएलएस और CLS. replicative (नवोदित) जीवन अवधि (आरएलएस) प्रेक्षण पर आधारित है कि खमीर माँ कोशिकाओं को 3-6 डिवीजनों के एक परिमित संख्या से गुजरना है. हम कालानुक्रमिक उम्र (CLS), एक गैर विभाजित संस्कृति में या 7-11 प्लेटों पर खमीर के कालानुक्रमिक अस्तित्व पर आधारित मॉडल पर ध्यान केंद्रित जंगली प्रकार 10-12 घंटे के लिए खमीर तेजी से सिंथेटिक dextrose पूरा मध्यम (एसडीसी) में बढ़ता है. . जब ग्लूकोज स्तर कम कर देता है, खमीर किण्वन से श्वसन करने के लिए स्विच, एक प्रक्रिया diauxic पारी करार दिया. कक्ष के बाद diauxic चरण के दौरान धीरे धीरे जी 0 गिरफ्तारी में प्रवेश करने से पहले लगभग 48 घंटे के लिए विभाजित जारी है. कोशिकाओं के चयापचय दर 5-6 दिन (0 दिन टीका दिन है) तक उच्च बनी हुई है. समय पर सेल व्यवहार्यता chronologically उम्र बढ़ने कोशिकाओं के प्रतिशत, हर दो दिन नमूना है, जो जी 0 गिरफ्तारी और अमीर YPED प्लेटों पर कालोनियों फार्म बाहर कर सकते हैं द्वारा पहुँचा जा सकता है .
1. संस्कृति में तरल खमीर कालानुक्रमिक उम्र (CLS)
- 1 मिलीलीटर सिंथेटिक पूरा ग्लूकोज मध्यम (एसडीसी, तालिका 1) में एक ही कॉलोनी टीका लगाना और 30 में मिलाते (220 आरपीएम) के साथ रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस स्वतंत्र कालोनियों से तीन inoculums प्रत्येक जैविक प्रतिकृतियां प्रदान तनाव के लिए तैयार रहना चाहिए.
- ताजा SDC माध्यम (आमतौर पर 10 मिलीलीटर) में आयुध डिपो के लिए रातोंरात संस्कृति पतला .05-0.1 = (~ कमजोर पड़ने 1:100) और 30 में मिलाते (220 rpm) के साथ सेते ° सी. इस समय बिंदु कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने के दिन 0 माना जाता है. / संस्कृति फ्लास्क मात्रा (50 मिलीलीटर में 10 मिलीलीटर, संस्कृति, या अब बड़े / 125 मिलीलीटर में 25 मिलीलीटर संस्कृति प्रयोगों के लिए) के 01:05 अनुपात को बनाए रखने के लिए उचित वातन सुनिश्चित करने के लिए.
- 3 दिन से शुरू, कुप्पी से 10 μl के 2 aliquots निकालने के लिए, autoclaved पानी, 10 μl पतला संस्कृति (यानी, 4 -10 10) में YEPD (1% खमीर निकालने, 2% bacto peptone, 2% डेक्सट्रोज 10,000 बार पतला , 2% अगर), प्लेटें, और 30 ° C पर 48-72 घंटे के लिए सेते पहले एकजुट (CFU) बनाने कॉलोनी में गिना जाता है.
- दिवस 3 CFU 100% अस्तित्व में माना जाता है. बाद के दिनों में उम्र बढ़ने की संस्कृति के कमजोर पड़ने कारक के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए ~ CFU परख 20-100 कालोनियों में (जैसे, 10 -10 4, 10 -30 4, 3, 10 -10 , आदि) को सुनिश्चित करने. DBY746 पृष्ठभूमि में जंगली प्रकार की कोशिकाओं के लिए, CLS 11 दिन के आसपास 1% अस्तित्व तक पहुँचता है.
सीटू व्यवहार्यता परख में बदलाव शामिल हैं :
- ग्लूकोज परिसीमन के द्वारा कैलोरी प्रतिबंध (सीआर). ग्लूकोज सीमित अनुसूचित जाति मध्यम में रातोंरात संस्कृति के कमजोर पड़ने (जैसे मानक 2% ग्लूकोज के बजाय 0.5 या 0.05% के रूप में) आम तौर पर 3 दिन और कम जनसंख्या संतृप्ति घनत्व के लिए सीसा, लेकिन ज्यादा मतलब है और अधिक से अधिक (10% अस्तित्व ) 12 उम्र बढ़ाया.
- चरम सीआर / भुखमरी के लिए, पानी की बराबर मात्रा में autoclaved पानी के साथ (resuspend कोशिकाओं और 2500 rpm पर 5 मिनट के लिए नीचे स्पिन 3 बार दोहराएँ) दिन 3 स्थिर चरण संस्कृति (आमतौर पर 3 ऊपर कदम के रूप में 10 मिलीग्राम) धोने. पानी में Incubationof कोशिकाओं भुखमरी हालत है कि खमीर जंगली में मुठभेड़ हो सकता है mimics. हर दो दिन बाद, बुढ़ापे संस्कृति autoclaved पानी से धोया होना चाहिए और पानी की बराबर मात्रा में resuspended lysed मृत कोशिकाओं से जारी किसी भी पोषक तत्वों को दूर. ऊपर वर्णित के रूप में उम्र बढ़ने संस्कृति नमूना व्यवहार्यता परख प्रदर्शन. यह भुखमरी हालत लगभग जंगली प्रकार DBY746 12 तनाव में मतलब CLS की एक दोहरीकरण के लिए नेतृत्व करेंगे .
2. सीटू व्यवहार्यता परख में
तरल संस्कृति में जीवित कोशिकाओं के एक छोटे से अंश कोशिका चक्र फिर से प्रवेश हो सकता है और शेष पोषक तत्वों या उन जारी मध्यम में मृत कोशिकाओं lysed फार्म का उपयोग बढ़ने के लिए, एक phenotype regrowth करार दिया / 13 हांफते. हम व्यवहार्यता पर एक प्लेट है कि DBY746 तनाव (trp1) के auxotrophy इस्तेमाल regrowth / हांफते समस्या को दरकिनार और भी निरंतर या विभिन्न बाहरी खमीर पोषक तत्वों या उत्तेजनाओं के जोखिम के अभाव के प्रभाव का परीक्षण की अनुमति एक प्रणाली विकसित 11 CLS. सीटू व्यवहार्यता परख में यह भी replicative उम्र ऐसी है कि कोशिकाओं को लगातार उम्र विश्लेषण की अवधि के लिए प्रचुर मात्रा में पोषक तत्वों को उजागर कर रहे हैं मॉडल mimics.
- 1 मिलीलीटर सिंथेटिक पूरा ग्लूकोज मध्यम (एसडीसी) में एक ही कॉलोनी टीका लगाना और 30 में मिलाते (220 आरपीएम) के साथ रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस स्वतंत्र कालोनियों से कम से कम तीन inoculums प्रत्येक जैविक प्रतिकृतियां प्रदान तनाव के लिए तैयार रहना चाहिए.
- चलो ~ 10 8 कोशिकाओं / एमएल (आयुध डिपो 600 = 10 ~) को विकसित करने के लिए संस्कृति, cell/10 100-200 (आमतौर पर 10 कमजोर पड़ने 4 गुना) μl और हज़ार cells/10 (μl culturewith autoclaved पानी पतला 10 3 गुना) कमजोर पड़ने.
- पतला संस्कृति की 10-30 μl के दो aliquots प्लेट एक tryptophan ख़ारिज किया हुआ एसडीसी की थाली पर. के लिएआर प्रत्येक तनाव, 8 से 20 प्लेटों का एक सेट तैयार करने और चढ़ाना घनत्व के अनुसार लेबल (जैसे, 10 4 गुना पतला, थाली 10 μl या 10 4 -10, चार 10 -30, -10, 10 3, 10, 3 -30 आदि), जो यह सुनिश्चित 10-100 कालोनियों उम्र बढ़ने के दौरान कमी आई व्यवहार्यता की प्रत्याशा में गिना जा सकता है है है.
- उम्र विश्लेषण की अवधि के लिए 30 ° C पर सेट थाली सेते हैं.
- चढ़ाना के दिन और हर दो दिन बाद में, एक प्लेट और ड्रॉप - वार हटाने 0.5 मिलीलीटर Tryptophan (2 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं को विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं. 30 ° C पर अतिरिक्त 48-72 घंटे के लिए थाली को सेते हैं. Tryptophan इसके अलावा के दिन पर व्यवहार्यता के लिए CFU गणना. चढ़ाना के दिन CFU 100% अस्तित्व में माना जाता है.
सीटू व्यवहार्यता परख में बदलाव शामिल हैं :
- अगर प्लेटों पर आयु कोशिकाओं (चरम भुखमरी की स्थिति). जोड़ें 1 मिलीलीटर 2x बाद के दिन पर tryptophan के बजाय YPED विकास और CFU 14 गिनती की अनुमति.
- विभिन्न कार्बन स्रोतों, जैसे ग्लूकोज के विभिन्न सांद्रता (ग्लूकोज सीमा द्वारा कैलोरी प्रतिबंध), इथेनॉल जैसे विभिन्न कार्बन स्रोतों, ग्लिसरॉल, एसिटिक एसिड 14 के साथ tryptophan ख़ारिज किया हुआ सिंथेटिक पूरा मध्यम के साथ प्लेटों पर आयु कोशिकाओं. विकास और CFU गिनती की अनुमति 1 मिलीलीटर ग्लूकोज / tryptophan समाधान (20% ग्लूकोज और 1mg/ml tryptophan) जोड़ें.
- नाइट्रोजन जैसे अन्य पोषक तत्व हेरफेर,.
3. डीएनए और कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने के दौरान उत्परिवर्तन आवृत्ति की क्षति
Canavanine प्रतिरोध (कर सकते हैं आर) और can1 अनुक्रमण
स्वतःस्फूर्त उत्परिवर्तन आवृत्ति chronologically उम्र बढ़ने संस्कृतियों में canavanine प्रतिरोध (कर सकते हैं नि.) की आवृत्ति को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. CAN1 (YEL063) जीन है, जो प्लाज्मा arginine permease encodes में उत्परिवर्तनों रेंडर arginine अनुरूप आर एल canavanine.Can अलग समय बिंदुओं पर एकत्र कालोनियों के लिए प्रतिरोधी कोशिकाओं को भी जीनोमिक डीएनए और CAN1 के बाद अनुक्रमण की निकासी के लिए सहेजा जा सकता है जीन है, जो उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम (उत्परिवर्तन सर्वेयर के साथ SoftGenetics) डेटा प्रदान कर सकते हैं.
बेस प्रतिस्थापन (टीआरपी reversions +)
Trp1-289 के साथ खींच TRP1 कोडन अनुक्रम में एक एम्बर उत्परिवर्तन (C403T) होते हैं . Trp1-289 की आवृत्ति की टीआरपी + 15 प्रत्यावर्तन के लिए मापन खमीर कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने के दौरान आधार प्रतिस्थापन दर के आकलन की अनुमति देता है.
फ़्रेम - पाली म्यूटेशनों
Lys - तनाव EH150 (माता, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3 Δ200, ura3-52, ade2 1o) एक lys2ΔBgl द्वितीय उत्परिवर्तन है कि 4 nucleotides डालने के लिए एक BGL LYS2 जीन में द्वितीय प्रतिबंध एंजाइम साइट बनाने के द्वारा निर्माण किया गया बंदरगाहों . परिणामस्वरूप lysine के लिए auxotrophy में खुला पढ़ने फ्रेम परिणाम है कि छोटे सम्मिलन / विलोपन 16-17 म्यूटेशनों द्वारा उलट हो सकता है है में चार बदलाव .
सकल गुणसूत्र rearrangements (GCRs)
सकल गुणसूत्र rearrangements (GCRs) का पता लगाने के लिए, हम एक उत्परिवर्ती तनाव उत्पन्न है, जिसमें HXT13 (YEL069), एक उच्च निरर्थक hexose ट्रांसपोर्टर एन्कोडिंग एक URA3 18 कैसेट द्वारा बाधित था HXT13 गुणसूत्र वी. उत्परिवर्तनों पर CAN1 के लिए 7.5 telomeric केबी स्थित दोनों CAN1 और URA3 जीन में एल canavanine और 5 fluoroorotic एसिड (5FOA) कोशिकाओं प्रतिरोध क्रमशः सौंपनेवाला,. बिंदु उत्परिवर्तन कि दोनों आर 5FOA r आवृत्ति के जीन के विश्लेषण में होते की कम आवृत्ति को ध्यान में रखते हुए कि दोनों जीनों के नुकसान में परिणाम GCRs के एक अनुमान प्रदान करता है.
मुताबिक़ पुनर्संयोजन और homeologous
या तो 100% ले जाने के मुताबिक़ औंधा (आईआरएस) दोहराता (pSR406: मुताबिक़ का स्तर (100%) और कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने के दौरान homeologous पुनर्संयोजन (91%) की निगरानी करने के लिए, हम म्यूटेंट जिसमें linearized plasmids (intron आईआर - HIS3 URA3) उत्पन्न ) या आईआरएस homeologous 91 HIS3 ठिकाना 19 पर (pSR407%). आईआरएस के बीच पुनर्संयोजन कार्यात्मक His3 प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है.
- सामान्य व्यवहार्यता परख (जैसा ऊपर वर्णित है) के लिए समानांतर में, उम्र बढ़ने की संस्कृति से कोशिकाओं के एक उचित राशि निकालने के लिए,
- आर उत्परिवर्तन कर सकते हैं के लिए, ~ 2x10 7 कोशिकाओं (200 दिन 3 संस्कृति के μl) के साथ शुरू;
- टीआरपी + प्रत्यावर्तन के लिए, ~ 10 8 कोशिकाओं (दिन 3 संस्कृति के 500-1000 μl) के साथ शुरू ;
- Lys + उत्परिवर्तन फ्रेम पारी के लिए, ~ 10 8 कोशिकाओं (दिन 3 संस्कृति के 500-1000 μl) के साथ शुरू;
- GCRs के लिए, 2-3x10 8 कोशिकाओं (2-3 दिन 3 संस्कृति के मिलीलीटर) के साथ शुरू ;
- मुताबिक़ पुनर्संयोजन और homeologous के लिए, टिल्ड और के साथ शुरू; 5x10 7 कोशिकाओं (दिन 3 संस्कृति के 200-500 μl);
- गोली पीठ टॉप अपकेंद्रित्र मशीन (5 मिनट के लिए 6000 rpm) के साथ कोशिकाओं.
- 1 मिलीलीटर autoclaved पानी, और गोली कोशिकाओं में कोशिकाओं को फिर से Resuspend.
- पानी की 100 μl में Resuspend सेल गोली. प्लेट कोशिकाओं,
- के लिए arginine ख़ारिज किया हुआ सिंथेटिक पूरा मध्यम प्लेटों पर r उत्परिवर्तन (SDC-Arg, 60 μg / मिलीलीटर एल canavanine सल्फेट के साथ) पूरक कर सकते हैं;
- टीआरपी + प्रत्यावर्तन के लिए, tryptophan छोड़ने वालों की प्लेटों पर (SDC-टीआरपी);
- Lys + उत्परिवर्तन फ्रेम पारी के लिए, lysine छोड़ने वालों की प्लेटों पर (SDC-Lys) ;
- GCRs के लिए, arginine छोड़ने वालों की प्लेटों पर (SDC-Arg) 5FOA (1 मिलीग्राम / एमएल) और एल canavanine सल्फेट (60 μg / मिलीलीटर) के साथ पूरक;
- मुताबिक़ पुनर्संयोजन और homeologous के लिए, हिस्टडीन छोड़ने वालों की प्लेटों पर galactose (2%) के साथ पूरक.
- 3-4 दिनों के ऊष्मायन के बाद 30 CFUs गणना डिग्री सेल्सियस उत्परिवर्तन आवृत्ति व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या के लिए सामान्यीकृत है.
सीटू व्यवहार्यता परख में करने के लिए पूरक, उम्र पर निर्भर टीआरपी + प्रत्यावर्तन, Lys + फ्रेम पारी उत्परिवर्तन, पुनर्संयोजन, आर या कर सकते हैं थाली पर वृद्ध कोशिकाओं में भी अध्ययन किया जा सकता है.
- टीआरपी, Lys, उनके बाहर निकाला हुआ, या एल canavanine सिंथेटिक पूरा मध्यम प्लेट (जैसा ऊपर वर्णित) पर प्लेट कोशिकाओं (~ 10 8 कोशिकाओं / प्लेट).
- हर दो दिन (या समय बिंदु पर ब्याज की), नए उभरते कालोनियों स्कोर.
- उत्परिवर्तन आवृत्ति विशिष्ट दिन के व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या के नए उभरते कालोनियों सामान्य अनुमान है.
4. Translesion संश्लेषण (टीएलएस)
उम्र पर निर्भर उत्परिवर्तन आवृत्ति में वृद्धि बढ़ macromolecule क्षति, कम सेलुलर संरक्षण / मरम्मत शामिल हो सकता है, और उम्र बढ़ने के दौरान गलत डीएनए की मरम्मत (जैसे Polζ निर्भर translesion संश्लेषण, TLS) की वृद्धि हुई. उदाहरण के लिए, लंबे समय रहते sch9 Δ म्यूटेंट SOD2 का ऊंचा अभिव्यक्ति प्रदर्शन, और त्रुटि - प्रवण डीएनए की मरम्मत एंजाइम 20 Rev1 की अभिव्यक्ति की कमी हुई. यहाँ हम एक क्षतिग्रस्त डीएनए टेम्पलेट और पूरे परमाणु निकालने के संयोजन के लिए इन विट्रो में टीएलएस मूल्यांकन परख का वर्णन.
- परमाणु निकालने की तैयारी वैंग एट अल द्वारा वर्णित के रूप में 21, बीसीए परख (पियर्स) के द्वारा प्रोटीन एकाग्रता यों.
- 50 μl (अंतिम मात्रा) TLS बफर (20 मिमी HEPES, 7 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी डीटीटी, 25 मिमी NaCl, पीएच 7.8), 200 μMdNTPs और 100 एनएम युक्त प्रतिक्रियाओं के लिए परमाणु के अर्क के 0, 5, 10, या 20 μg जोड़ें 5'-32 पी लेबल 12 पूर्व प्राइमर (5'-CGA TGG टीएसी GGA-3 ') 48 पूर्व हित के डीएनए की क्षति (5'-TCG एटीए CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC युक्त टेम्पलेट के लिए annealed ACG टीसीसी GTA सीसीए TCG-3 ', जिसमें एक्स क्षतिग्रस्त साइट, जैसे है, abasic साइट, 8 oxo - जी, आदि).
- 30 में मिश्रण सेते डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए, 2.5 μl EDTA (20 मिमी) और proteinase कश्मीर (10 मिलीग्राम / एमएल) की 2 μl के अलावा के साथ प्रतिक्रिया को समाप्त.
- Phenol के निष्कर्षण और इथेनॉल वर्षण के साथ डीएनए शुद्ध.
- जेल लोड हो रहा है बफर के 50 μl में Resuspend डीएनए (98% formamide, 20 मिमी EDTA, और डाई).
- 19% polyacrylamide जैल पर translesion संश्लेषण उत्पादों संकल्प.
- यों phosphorimaging (चित्रा 1) का उपयोग TLS .
5. प्रतिनिधि परिणाम
हम आम तौर पर 3 दिन मानक तरल CLS विश्लेषण में 100 प्रतिशत अस्तित्व CFU मायने रखता है के रूप में इस्तेमाल किया. बाद के दिनों में प्रतिशत अस्तित्व मतलब (50% अस्तित्व) की गणना करने के लिए लगाया जा सकता है है और अधिकतम जीवन (10% अस्तित्व) 12 spans. जीवन काल सीटू व्यवहार्यता परख में से परिणाम प्राप्त आम तौर पर तरल CLS परख का उपयोग उन लोगों के साथ संगत कर रहे हैं, लेकिन साथ मतलब जीवन काल है, जो भाग में तथ्य यह है कि कोशिकाओं को लगातार पोषक तत्वों को उजागर कर रहे कारण है कम. ग्लूकोज की उपस्थिति रोकता सेलुलर संरक्षण की गतिविधि के रूप में Msn2 / 4 और Gis1 12 के रूप में तनाव प्रतिक्रिया प्रतिलेखन कारक के कम transactivation से पता चला है.
आयु पर निर्भर उत्परिवर्तन आवृत्ति बहुत तनाव पृष्ठभूमि, आनुवंशिक हेरफेर, संस्कृति शर्तों, और उम्र पर निर्भर करता है. तालिका 2 ठेठ जंगली प्रकार तनाव (DBY746) में प्राप्त परिणामों से पता चलता है.
| घटक | छ / एल |
|---|---|
| डी शर्करा | 20 |
| अमोनियम सल्फेट | 5 |
| नाइट्रोजन बेस (-AS/-AA) | 1.8 |
| NaH2PO4 | 1.4 |
| मिलीग्राम / एल | |
| Adenine | 80 |
| एल Arginine | 40 |
| एल Aspartic एसिड | 100 |
| एल Glutamic एसिड | 100 |
| एल-हिस्टडीन | 80 |
| एल - Isoleucine | 60 |
| एल - Leucine | 120 |
| एल Lysine | 60 |
| एल-Methionine | 80 |
| एल-फेनिलएलनिन | 60 |
| एल - सेरीन | 400 |
| एल - threonine | 200 |
| एल - Tryptophan | 80 |
| एल - Tyrosine | 40 |
| एल-valine | 150 |
| Uracil | 80 |
तालिका 1 सिंथेटिक पूरा ग्लूकोज मध्यम, एसडीसी (NaOH साथ पीएच 6.0 करने के लिए समायोजित). हिस्टडीन 4 गुना से अधिक, leucine, tryptophan, और uracil DBY746 तनाव के auxotrophy क्षतिपूर्ति शामिल हैं.
| दिन 3 (± SEM मतलब) | अप करने के लिए (उम्र बढ़ने के दौरान) | |
|---|---|---|
| R कर सकते हैं | 1.76 ± 0.12 -6 x10 | 6-8 -6 x10 |
| टीआरपी + प्रत्यावर्तन | 6.60 ± 1.70 -8 x10 | 1.60 -6 x10 |
| Lys + उत्परिवर्तन फ्रेम पारी | 3.00 ± 0.78 -8 x10 | 0.70 -6 x10 |
| GCRs | 0.62 ± 0.10 x10 -8 | 0.30 -6 x10 |
| मुताबिक़ पुनर्संयोजन | 5.55 ± 2.74 -6 x10 | 27.00 -6 x10 |
| Homeologous पुनर्संयोजन | 0.12 ± 0.04 x10 -6 | 0.48 -6 x10 |
तालिका 2 जंगली प्रकार की कोशिकाओं के विशिष्ट उत्परिवर्तन कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने के दौरान (DBY746) आवृत्तियों .
चित्रा 1 translesion (टीएलएस) का संश्लेषण 20 के परिणाम. 3 दिन पुरानी स्थिर जंगली प्रकार चरण (DBY746) और sch9 Δ उत्परिवर्ती कोशिकाओं से परमाणु अर्क undamaged या abasic साइट युक्त 30 मिनट के लिए डीएनए टेम्पलेट्स के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे थे टीएलएस उत्पादों ठोस (undamaged टेम्पलेट के साथ) या बिंदीदार (क्षतिग्रस्त टेम्पलेट के साथ) लाइनों संकेत कर रहे हैं. वहाँ कोई translesion sch9 Δ म्यूटेंट से परमाणु निकालने में मनाया संश्लेषण किया गया था. मुफ्त प्राइमरों खुला तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं.
Discussion
लिक्विड उम्र बढ़ने संस्कृतियों कुछ समय regrowth / हांफते 13 phenotype, जो CLS विश्लेषण पेचीदा दिखा रहे हैं. Regrowth आम तौर पर तब होता है जब जनसंख्या का 90-99% से अधिक व्यवहार्यता खो दिया है. इस phenotype अक्सर बढ़ oxidative तनाव और / या सेल में कमी आई संरक्षण के साथ जुड़ा हुआ है. उदाहरण के लिए, इस phenotype की आवृत्ति साइटोसोलिक superoxide dismutase कमी कोशिकाओं में युगल की तुलना में अधिक है और बहुत लंबे समय रहते म्यूटेंट में कम कर देता है (जैसे, sch9 Δ या ras2 Δ) या म्यूटेंट overexpressing superoxide 22 dismutases. व्यवहार में, हम या कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने के दौरान उच्च मृत्यु दर चरण में लगातार 3 samplings के लिए व्यवहार्यता में व्यवहार्यता स्थिरीकरण में वृद्धि के रूप में regrowth को परिभाषित.
अलग डीएनए म्यूटेशनों की आयु पर निर्भर आवृत्तियों काफी तनाव पृष्ठभूमि, आनुवंशिक हेरफेर, संस्कृति शर्तों, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से regrowth हांफते / और बेहद कम अस्तित्व के आधार पर बदलती हैं. पूर्व प्रयोगों जैसे उत्परिवर्तन assays के लिए विभिन्न चढ़ाना घनत्व के साथ मतलब है और अधिकतम अस्तित्व के लिए performingthe पूर्ण पैमाने पर जीवन काल विश्लेषण से पहले उत्परिवर्तन आवृत्ति रेंज निर्धारित समय बिंदुओं पर बाहर किया जाना चाहिए. जंगली प्रकार तनाव हमेशा एक जीवन काल या उत्परिवर्तन आवृत्ति अध्ययन में शामिल किया जाना चाहिए किसी भी उपचार या आनुवंशिक उत्परिवर्ती के लिए समानांतर में, ऐसी है कि अंतर - प्रयोग रूपांतरों के लिए जिम्मेदार किया जा सकता है है. एकाधिक जैविक प्रतिकृतियां अध्ययन में शामिल किया जाना चाहिए, और दोनों तरल और सीटू / व्यवहार्यता उत्परिवर्तन assays में बाहर किया जाना चाहिए के लिए परिणामों को परिपुष्ट करना.
डीएनए उत्परिवर्तन के विशिष्ट प्रकार, उम्र पर निर्भर जीनोमिक अस्थिरता के संयोजन में एकाधिक assays का उपयोग रूपरेखा पर ध्यान केंद्रित करने के बजाय, विशिष्ट डीएनए की क्षति और डीएनए क्षति की मरम्मत (ओं) प्रणाली है कि उम्र पर निर्भर जीनोमिक अस्थिरता के लिए योगदान पर प्रकाश डाला सकता है. उदाहरण के लिए, सकल गुणसूत्र rearrangements (GCRs) में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई है, अन्य डीएनए म्यूटेशनों के उन लोगों की तुलना में जंगली प्रकार खमीर में मनाया जाता है एक डबल भूग्रस्त elevationof तोड़ने के लिए और / या गैर मुताबिक़ अंत में एक हानि में शामिल होने के दौरान खमीर (NHEJ) सुझाव कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने (तालिका 2). can1 उत्परिवर्तन (जीन CAN1 के अनुक्रमण) स्पेक्ट्रम जंगली प्रकार बुढ़ापे खमीर में प्राप्त कालानुक्रमिक उम्र बढ़ने और त्रुटि - प्रवण डीएनए की मरम्मत के दौरान oxidative नुकसान में वृद्धि का सुझाव दिया है, है जबकि लंबे समय रहते sch9 Δ म्यूटेंट में, कम oxidative डीएनए की क्षति और बहुत कम त्रुटि ग्रस्त translesion संश्लेषण 20 मनाया गया.
यहाँ वर्णित विधियों आगे उम्र पर निर्भर जीनोमिक अस्थिरता का अध्ययन करने के लिए खर्च कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, मौन और गैर - मौन कोशिकाओं स्थिर चरण खमीर संस्कृतियों घनत्व ढाल एलन एट अल द्वारा वर्णित विधि का उपयोग कर से अलग किया जा सकता है है 23. . उत्परिवर्तन यहाँ वर्णित assays के साथ संयुक्त, हम रिपोर्ट है कि उम्र पर निर्भर परिवर्तन के एक बड़े हिस्से में विभाजित, क्षतिग्रस्त या apoptotic कोशिकाओं 20,24 के बजाय मौन कोशिकाओं, से उठता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम plasmids और खमीर उपभेदों प्रदान करने के लिए एस चहलपहल रॉबर्टसन और ई. हेडेनरीच धन्यवाद, मदद withthe टीएलएस परख के लिए पी. फाम और म्यूचुअल फंड गुडमैन. इस काम के हिस्से में, उम्र बढ़ने अनुसंधान अनुदान के लिए अमेरिकन फेडरेशन द्वारा और AG20642 एनआईएच, AG025135 द्वारा समर्थित किया गया.
References
- Longo, V. D., Finch, C. E. Evolutionary medicine: from dwarf model systems to healthy centenarians. Science. 299, 1342-1346 (2003).
- Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span--from yeast to humans. Science. 328, 321-326 (2010).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183, 1751-1752 (1959).
- Muller, I., Zimmermann, M., Becker, D., Flomer, M. Calendar life span versus budding life span of Saccharomyces cerevisiae. Mech. Ageing Dev. 12, 47-52 (1980).
- Jazwinski, S. M., Egilmez, N. K., Chen, J. B. Replication control and cellular life span. Exp. Gerontol. 24, 423-436 (1989).
- Pohley, H. J. A formal mortality analysis for populations of unicellular organisms (Saccharomyces cerevisiae. Mech Ageing Dev. 38, 231-243 (1987).
- Longo, V. D., Gralla, E. B., Valentine, J. S. Superoxide dismutase activity is essential for stationary phase survival in Saccharomyces cerevisiae. Mitochondrial production of toxic oxygen species in vivo. J Biol Chem. 271, 12275-12280 (1996).
- Longo, V. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Studies of superoxide dismutase, Ras and Bcl-2 [dissertation]. , University of California Los Angeles. California Los Angeles. (1997).
- Fabrizio, P., Pozza, F., Pletcher, S. D., Gendron, C. M., Longo, V. D. Regulation of longevity and stress resistance by Sch9 in yeast. Science. 292, 288-290 (2001).
- Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2, 73-81 (2003).
- Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer. Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).
- Wei, M. Life span extension by calorie restriction depends on Rim15 and transcription factors downstream of Ras/PKA, Tor, and Sch9. PLoS Genet. 4, e13-e13 (2008).
- Fabrizio, P. Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 166, 1055-1067 (2004).
- Wei, M. Tor1/Sch9-regulated carbon source substitution is as effective as calorie restriction in life span extension. PLoS Genet. 5, e1000467-e1000467 (2009).
- Capizzi, R. L., Jameson, J. W. A table for the estimation of the spontaneous mutation rate of cells in culture. Mutat Res. 17, 147-148 (1973).
- Heidenreich, E., Novotny, R., Kneidinger, B., Holzmann, V., Wintersberger, U. Non-homologous end joining as an important mutagenic process in cell cycle-arrested cells. Embo J. 22, 2274-2283 (2003).
- Heidenreich, E., Wintersberger, U. Replication-dependent and selection-induced mutations in respiration-competent and respiration-deficient strains of Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 260, 395-400 (1998).
- Chen, C., Kolodner, R. D. Gross chromosomal rearrangements in Saccharomyces cerevisiae replication and recombination defective mutants. Nat Genet. 23, 81-85 (1999).
- Datta, A., Adjiri, A., New, L., Crouse, G. F., JinksRobertson, S. Mitotic crossovers between diverged sequences are regulated by mismatch repair proteins in Saccaromyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16, 1085-1093 (1996).
- Madia, F. Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism. J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).
- Wang, Z. Controlled expression of recombinant genes and preparation of cell-free extracts in yeast. Methods Mol Biol. 313, 317-331 (2006).
- Fabrizio, P., Pletcher, S. D., Minois, N., Vaupel, J. W., Longo, V. D. Chronological aging-independent replicative life span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 557, 136-142 (2004).
- Allen, C. Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures. J Cell Biol. 174, 89-100 (2006).
- Madia, F. Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system. J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).
