Summary
Qui si descrive un insieme di saggi di mutazione del DNA che possono essere combinati con il modello lievito arco cronologico della vita a studiare i geni / percorsi che regolano o contribuire all'instabilità DNA genomico durante l'invecchiamento.
Abstract
Gli studi che utilizzano il modello Saccharomyces cerevisiae invecchiamento hanno scoperto percorsi durata regolamentare vita che sono in parte conservati in eucarioti superiori 1-2. La semplicità e la potenza del modello di lievito di invecchiamento può essere esplorata per studiare il danno al DNA e la manutenzione del genoma, nonché il loro contributo alle malattie durante l'invecchiamento. Qui, descriviamo un sistema per studiare età-dipendente mutazioni del DNA, tra cui sostituzioni di basi, mutazioni frame-shift, al lordo riarrangiamenti cromosomici e omologa / homeologous ricombinazione, così come l'attività di riparazione del DNA nucleare, combinando l'arco cronologico lievito della vita con il DNA semplice danni e saggi di mutazione. I metodi descritti qui dovrebbe facilitare l'identificazione di geni / percorsi che regolano l'instabilità genomica ed i meccanismi che sono alla base età-dipendente mutazioni del DNA e il cancro nei mammiferi.
Protocol
Due modelli di vita hanno usato per studiare l'invecchiamento in S. cerevisiae: RLS e CLS. La (in erba) la durata della vita replicativa (RLS) si basa sull'osservazione che le cellule di lievito madre subiscono un numero finito di divisioni 3-6. Ci concentreremo sulla durata della vita cronologico (CLS), un modello basato sulla sopravvivenza cronologico di non dividere il lievito in coltura o su piastre 7-11. Lievito tipo selvatico cresce in modo esponenziale per 10-12 ore in sintetico destrosio completa (DSC) di media . Quando il livello di glucosio riduce, interruttori lievito da fermentazione alla respirazione, un processo chiamato spostamento diauxic. Cellule continuano a dividersi lentamente durante la fase di post-diauxic per circa 48 ore prima di entrare G 0 arresto. Il tasso metabolico delle cellule rimane alta fino al giorno 5-6 (giorno 0 è il giorno inoculazione). La vitalità delle cellule nel corso del tempo si può accedere dalla percentuale di cellule invecchiamento cronologico, campionati ogni due giorni, che può uscire da G 0 arresti e formare colonie su ricchi piatti YPED.
1. Lievito cronologico durata di vita (CLS) in coltura liquida
- Inoculare una singola colonia in 1 ml di glucosio terreno sintetico completo (DSC, Tabella 1) e incubare una notte con agitazione (220 rpm) a 30 ° C. Tre inoculums dalle colonie indipendenti dovrebbero essere preparati per ogni sforzo per fornire repliche biologiche.
- Diluire la cultura in una notte fresca medio della DSC (in genere 10 ml) di OD = 0,05-0,1 (~ diluizione 1:100) e incubare con agitazione (220 rpm) a 30 ° C. Questo punto è considerato tempo 0 giorni dell'invecchiamento cronologico. Mantenere un rapporto 1:5 di cultura / fiasco del volume (10 ml di cultura in 50 ml, o per gli esperimenti più / grande cultura 25 ml in 125 ml) per garantire la corretta aerazione.
- A partire dal giorno 3, rimuovere 2 aliquote da 10 microlitri dal pallone, diluire 10.000 volte in acqua in autoclave, 10 microlitri cultura diluito (ovvero, 10 4 -10) su YEPD (1 estratto di lievito%, 2% bacto peptone, 2% di destrosio , 2% agar) piastre e incubare a 30 ° C per 48-72 ore prima formanti colonia unire (CFU) viene contato.
- Giorno 3 CFU è considerato al 100% la sopravvivenza. Fattori di diluizione della cultura invecchiamento nei giorni successivi deve essere aggiustato di conseguenza per assicurare ~ 20-100 colonie nel test CFU (ad esempio, 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, ecc.) Per le cellule di tipo selvatico in background DBY746, la CLS raggiunge l'1% di sopravvivenza intorno al giorno 11.
Variazioni di test in situ viabilità comprendono:
- Restrizione calorica (CR) di limitazione del glucosio. Diluizione della cultura durante la notte in media glucosio limitata SC (come 0,5 o 0,05% al posto del glucosio standard 2%) in genere portare a bassa densità di popolazione di saturazione al giorno 3, ma molto esteso media e massima (10% di sopravvivenza) la durata della vita 12.
- Per estremi CR / fame, lavare il giorno 3 cultura fase stazionaria (in genere 10 ml, come nel punto 3) con acqua autoclavato (risospendere le cellule in uguale volume di acqua e spin down a 2500 rpm per 5 minuti, ripetere 3 volte). Cellule Incubationof in acqua simula la condizione di fame che il lievito può incontrare allo stato selvatico. Ogni due giorni poi, la cultura invecchiamento devono essere lavati con acqua in autoclave e risospesi in volume uguale di acqua per rimuovere ogni nutrienti rilasciati dal lisato le cellule morte. Eseguire test vitalità campionando la cultura invecchiamento come descritto sopra. Questa condizione fame sarà portato a quasi un raddoppio del CLS medio nel wild type DBY746 ceppo 12.
2. Test in situ vitalità
Nella cultura liquido, una piccola frazione di cellule sopravvissute possono ri-entrato nel ciclo cellulare e crescere utilizzando sostanze nutritive restanti o quelli modulo rilasciato lisate le cellule morte nel mezzo, un fenotipo definito ricrescita / ansimante 13. Abbiamo sviluppato una vitalità-on-a-plate sistema che utilizza la auxotrophy del ceppo DBY746 (TRP1) per eludere la ricrescita / ansimante problema e permettono anche la verifica degli effetti della esposizione costante o privazione di varie sostanze nutritive o stimoli esterni sui lieviti CLS 11. Questo test in situ vitalità imita anche il modello replicativo durata della vita in modo tale che le cellule sono costantemente esposti alle sostanze nutritive abbondante per tutta la durata dell'analisi vita.
- Inoculare una singola colonia in 1 ml di glucosio terreno sintetico completo (DSC) e incubare una notte con agitazione (220 rpm) a 30 ° C. Almeno tre inoculums da colonie indipendenti dovrebbero essere preparati per ogni sforzo per fornire repliche biologiche.
- Che la cultura per crescere a ~ 10 8 cellule / ml (OD 600 = ~ 10), diluire l'acqua culturewith autoclavati a 100-200 cell/10 microlitri (di solito 10 4 volte diluizione) e 1.000 cells/10 microlitri (10 3 -diluizione).
- Piastra di due aliquote di 10-30 ml di coltura diluita su una piastra di triptofano abbandono della DSC. Perr ogni ceppo, preparare una serie da 8 a 20 piastre ed etichettato in base alla densità placcatura (ad esempio, 10 4 volte diluita, tavola 10 microlitri o 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, 10 3 -30 , ecc), che assicurano 10-100 colonie possono essere contate in previsione di redditività è diminuita durante l'invecchiamento.
- Incubare la piastra fissata a 30 ° C per tutta la durata dell'analisi vita.
- Il giorno della placcatura e successivamente ogni 2 giorni, rimuovere una piastra e aggiungere goccia a goccia 0,5 ml Triptofano (2 mg / ml) per permettere cellule vitali per crescere. Incubare la piastra a 30 ° C per ulteriori 48-72 ore. Contare i CFU per la vitalità del giorno di aggiunta triptofano. Il CFU, al momento della placcatura è considerata al 100% la sopravvivenza.
Variazioni di test in situ viabilità comprendono:
- Età cellule su piastre di agar (condizione di fame estrema). Aggiungere 1 ml di 2x YPED invece di triptofano nei giorni successivi per permettere la crescita e CFU contano 14.
- Celle di età su piastre con triptofano medio di abbandono sintetico completa di fonti di carbonio diversi, ad esempio, varie concentrazioni di glucosio (restrizione calorica da limitazione glucosio), varie fonti di carbonio come l'etanolo, glicerina, acido acetico 14. Aggiungere 1 ml di glucosio / soluzione triptofano (20% glucosio e 1mg/ml triptofano) per consentire la crescita e contare CFU.
- Altri manipolazione dei nutrienti, come l'azoto.
3. Danno al DNA e della frequenza di mutazione durante l'invecchiamento cronologico
Canavanina resistenza (Can r) e CAN1 sequenziamento
Frequenza di mutazioni spontanee può essere valutata misurando la frequenza di resistenza canavanina (Can r) nelle culture cronologicamente invecchiamento. Le mutazioni nel (YEL063) CAN1 gene, che codifica per il plasma arginina permeasi, rendere le cellule resistenti alla L-arginina analogico canavanine.Can colonie r raccolti in diversi momenti possono anche essere salvati per l'estrazione di DNA genomico e la sequenza successiva del CAN1 gene, in grado di fornire i dati dello spettro di mutazione (mutazione con Surveyor, SoftGenetics).
Sostituzioni di basi (Trp + ritorni)
Ceppi con TRP1-289 contiene una mutazione ambra (C403T) nella sequenza TRP1 codifica. Misura della frequenza di TRP1-289 alla riversione Trp + 15 consente la stima del tasso base sostituzione durante l'invecchiamento cronologico lievito.
Mutazioni frame-shift
Il Lys - ceppo EH150 (Mata, lys2ΔBglII, TRP1-Δ, his3-Δ200, ura3-52, ade2-1o) ospita una mutazione lys2ΔBgl II che è stato costruito con l'inserimento di quattro nucleotidi di creare una restrizione Bgl II sito degli enzimi del gene LYS2 . Il conseguente spostamento di 4 risultati open frame lettura in auxotrophy della lisina, che può essere invertita da piccoli inserzione / delezione mutazioni 16-17.
Lordo riarrangiamenti cromosomici (GCR)
Per rilevare lordo riarrangiamenti cromosomici (GCR), abbiamo generato un ceppo mutante, in cui HXT13 (YEL069), che codifica per un trasportatore esoso altamente ridondanti, è stata interrotta da una cassetta URA3 18. HXT13 si trova a 7,5 kb telomerica CAN1 sul cromosoma V. Mutazioni in entrambi i CAN1 e URA3 geni rendere resistenza alle cellule di L-canavanina e 5-fluoroorotic acido (5FOA), rispettivamente. Considerando la bassa frequenza di mutazioni puntiformi che si verificano in entrambi i geni, l'analisi della possibile 5FOA r r frequenza fornisce una stima della GCR che provocano la perdita di entrambi i geni.
Ricombinazione omologa e homeologous
Per monitorare il livello di omologhi (100%) e la ricombinazione homeologous (91%) durante l'invecchiamento cronologico, abbiamo generato mutanti in cui plasmidi linearizzati (HIS3:: introne-IR-URA3) portando entrambi al 100% ripete omologo invertite (IR) (pSR406 ) o 91% homeologous IRS (pSR407) al HIS3 locus 19. Ricombinazione tra l'IRS permette l'espressione della proteina funzionale His3.
- In parallelo al test vitalità normale (come descritto sopra), rimuovere una quantità appropriata di cellule dalla cultura invecchiamento,
- di mutazione può r, iniziare con ~ 2x10 7 celle (200 ml di giorno 3 cultura);
- per il ritorno Trp +, inizia con ~ 10 8 celle (500-1000 ml di giorno 3 cultura);
- per Lys + frame-shift mutazione, inizia con ~ 10 8 celle (500-1000 ml di giorno 3 cultura);
- per GCR, iniziare con 2-3x10 8 celle (2-3 ml del giorno 3 cultura);
- per la ricombinazione omologa e homeologous, inizia con & tilde; 5x10 7 celle (200-500 ml di giorno 3 cultura);
- Agglomerare le cellule con il banco macchina centrifuga (6000 rpm per 5 min).
- Risospendere le cellule in 1 ml di acqua in autoclave, e agglomerare le cellule di nuovo.
- Risospendere il pellet cellulare in 100 ml di acqua. Piastra di cellule,
- per Can mutazione r, in arginina-dropout piastre sintetico terreno completo (DSC-Arg, integrata con 60 mg / ml L-canavanina solfato);
- per il ritorno Trp +, il triptofano-dropout piastre (DSC-Trp);
- per Lys + frame-shift mutazione, sul lisina-dropout piastre (DSC-Lys);
- per il GCR, il arginina-dropout piastre (DSC-Arg) integrato con 5FOA (1 mg / ml) e L-canavanina solfato (60 mg / ml);
- per la ricombinazione omologa e homeologous, in istidina-abbandono piastre completato con galattosio (2%).
- Conte CFU dopo incubazione di 3-4 giorni 'a 30 ° C. La frequenza di mutazione è normalizzata al numero di cellule vitali.
Complementare al test in situ vitalità, età-dipendente Trp ritorno + Lys + frame-shift mutazione, ricombinazione, o Can r può anche essere studiato in cellule invecchiate sul piatto.
- Cellule piastra (~ 10 8 cellule / piastra) su piatti sintetici Trp-,-Lys, His-abbandono, o L-canavanina terreno completo (come descritto sopra).
- Ogni due giorni (o per il punto temporale di interesse), il punteggio delle colonie emergenti.
- Frequenza di mutazione è stimata normalizzando colonie emergenti per il numero totale delle cellule vitali del giorno specifico.
4. Translesion sintesi (TLS)
L'età-dipendente aumento della frequenza di mutazione può comportare maggiori danni macromolecola, diminuita protezione cellulare / riparazione e aumento riparazione del DNA errate (come Polζ-dipendente sintesi translesion, TLS) durante l'invecchiamento. Ad esempio, il longevo sch9 mutanti Δ mostra espressione elevata di SOD2, e ridotta espressione del soggetto a errori di riparazione del DNA enzima Rev1 20. Qui si descrive un saggio che unisce modello di DNA danneggiato e di tutto estrarre nucleare per valutare la TLS in vitro.
- Preparare l'estratto nucleare come descritto da Wang et al 21;. Quantificare la concentrazione di proteine da saggio BCA (Pierce).
- Aggiungi mcg 0, 5, 10 o 20 di estratti nucleari a 50 microlitri (volume finale) reazioni contenente TLS buffer (20 mM HEPES, 7 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 7,8), 200 e 100 nM μMdNTPs 5'-32 P-12-etichettati mer primer (5'-CGA TGG TAC GGA-3 ') ricotto ad un 48-mer modello contenente danno al DNA di interesse (5'-GCC ATA CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC ACG TCC GTA CCA TCG-3 ', in cui X è il sito danneggiato, per esempio, il sito abasic, 8-oxo-G, ecc.)
- Incubare la miscela a 30 ° C per 30 minuti, terminare la reazione con l'aggiunta di 2,5 microlitri EDTA (20 mm) e 2 ml di proteinasi K (10 mg / mL).
- Purificare l'estrazione del DNA con fenolo e precipitazione in etanolo.
- DNA Risospendere in 50 ml di tampone di caricamento del gel (98% formammide, 20 mM EDTA, e tintura).
- Risolvere i prodotti di sintesi translesion su gel di poliacrilammide 19%.
- Quantificare il TLS utilizzando phosphorimaging (Figura 1).
5. Rappresentante Risultati
Noi di solito usato i conteggi CFU il giorno 3 come sopravvivenza del 100 per cento dello standard analisi dei liquidi CLS. La percentuale di sopravvivenza nei giorni successivi può essere montato a calcolare la media (50% di sopravvivenza) e massimo (10% di sopravvivenza) la vita si estende su 12. Risultati ottenuti da vita nel test vitalità situ sono generalmente coerenti con quelli che utilizzano il test liquido CLS, ma con ridotto la durata media della vita, che è dovuto in parte al fatto che le cellule sono costantemente esposti a sostanze nutritive. Presenza di glucosio inibisce l'attività di protezione cellulare, come dimostrato dal ridotto transattivazione del fattore di trascrizione risposta allo stress, come Msn2 / 4 e Gis1 12.
Età-dipendente della frequenza di mutazione varia notevolmente a seconda della priorità bassa tensione, la manipolazione genetica, condizioni di coltura, e l'età. La tabella 2 mostra i risultati tipici ottenuti nel ceppo selvatico (DBY746).
| Componente | g / L |
|---|---|
| D-glucosio | 20 |
| Solfato di ammonio | 5 |
| Base di azoto (-AS/-AA) | 1,8 |
| NaH2PO4 | 1,4 |
| mg / L | |
| Adenina | 80 |
| L-Arginina | 40 |
| L-acido aspartico | 100 |
| L-acido glutammico | 100 |
| L-Istidina | 80 |
| L-Isoleucina | 60 |
| L-Leucina | 120 |
| L-lisina | 60 |
| L-metionina | 80 |
| L-Fenilalanina | 60 |
| L-Serina | 400 |
| L-treonina | 200 |
| L-triptofano | 80 |
| L-tirosina | 40 |
| L-Valina | 150 |
| Uracile | 80 |
Tabella 1. Sintetico medio di glucosio completa, DSC (regolare a pH 6,0 con NaOH). Di 4 volte l'eccesso di istidina, leucina, triptofano, uracile e sono inclusi per compensare la auxotrophy del ceppo DBY746.
| Giorno 3 (media ± SEM) | Fino a (durante l'invecchiamento) | |
|---|---|---|
| Può r | 1,76 ± 0,12 x10 -6 | 6-8 x10 -6 |
| Trp + ritorno | 6,60 ± 1,70 x10 -8 | 1,60 x10 -6 |
| Lys + frame-shift mutazione | 3,00 ± 0,78 x10 -8 | 0,70 x10 -6 |
| GCR | 0,62 ± 0,10 x10 -8 | 0,30 x10 -6 |
| Ricombinazione omologa | 5,55 ± 2,74 x10 -6 | 27,00 x10 -6 |
| Ricombinazione Homeologous | 0,12 ± 0,04 x10 -6 | 0,48 x10 -6 |
Tabella 2. Frequenze mutazione tipica delle cellule wild-type (DBY746) durante l'invecchiamento cronologico.
Figura 1. Risultato di sintesi translesion (TLS) 20. Estratti nucleari da 3 giorni di età fase stazionaria wild-type (DBY746) e sch9 Δ cellule mutanti sono state incubate con danneggiato o abasic sito contenente modelli di DNA per 30 minuti a 30 ° C. Prodotti TLS sono indicati da solide (con template non danneggiato) o punteggiata (con modello danneggiato) linee. Non c'era sintesi translesion osservato in estratto nucleare da sch9 mutanti Δ. Primer liberi sono indicati dalla freccia aperta.
Discussion
Liquido culture invecchiamento volte esibire la ricrescita / ansimante fenotipo 13, il che complica l'analisi CLS. Ricrescita si verifica in genere quando più di 90-99% della popolazione ha perso vitalità. Questo fenotipo è spesso associata ad un aumento dello stress ossidativo e / o di protezione è diminuita nella cella. Per esempio, la frequenza di questo fenotipo più che raddoppia in celle prive superossido dismutasi citosolica e riduce notevolmente in longevo mutanti (per esempio, o ras2 sch9 Δ Δ) o mutanti superossido dismutasi sovraesprimono 22. In pratica, definiamo la ricrescita come un aumento della redditività o la stabilizzazione della redditività per 3 campionamenti successivi nella fase alta mortalità durante l'invecchiamento cronologico.
Età-dipendente frequenze delle mutazioni del DNA differenti variano notevolmente a seconda della priorità bassa tensione, la manipolazione genetica, condizioni di coltura, così come la ricrescita / ansimante e la sopravvivenza estremamente basso. Pre-esperimenti devono essere effettuati presso punti al momento in cui la sopravvivenza media e massima densità di placcatura vari test di mutazione per determinare la frequenza di mutazione prima performingthe gamma completa analisi durata scala. Il ceppo di tipo selvatico deve sempre essere inclusi in una vita di studio o frequenza di mutazione in parallelo a qualsiasi trattamento o mutanti genetici, in modo che inter-esperimento-variazioni possono essere spiegate. Molteplici repliche biologici dovrebbero essere inclusi nello studio, e, sia liquidi che in situ vitalità / mutazione test dovrebbe essere effettuato per corroborare i risultati.
Invece di concentrarsi su uno specifico tipo di mutazione del DNA, profili di età-dipendente instabilità genomica usando saggi più in combinazione, possono far luce sul danno al DNA specifico e danni al sistema di riparazione del DNA (s) che contribuiscono a età-dipendente instabilità genomica. Per esempio, un significativo aumento lordo riarrangiamenti cromosomici (GCR), rispetto a quelli di altre mutazioni del DNA, si osserva nel lievito di tipo selvatico suggerendo una pausa elevationof doppio filamento e / o danni a non omologhe fine unirsi (NHEJ) durante lievito invecchiamento cronologico (Tabella 2). Lo spettro di mutazione CAN1 (sequenziamento del gene CAN1) ottenuti nelle wild-type lievito invecchiamento suggerito un aumento del danno ossidativo durante l'invecchiamento cronologico e soggetto a errori di riparazione del DNA e che, a lungo vissuto sch9 mutanti Δ, danno al DNA meno ossidativo e molto ridotto soggetto a errori sintesi translesion sono stati osservati 20.
Metodi qui descritti possono essere ulteriormente speso per studiare età-dipendente instabilità genomica. Per esempio, le cellule quiescenti e non-riposo può essere isolato dal lievito stazionaria fase culture utilizzando il metodo del gradiente di densità descritto da Allen et al. 23. In combinazione con il test di mutazione descritta qui, abbiamo riportato che una gran parte di età-dipendente mutazioni nasce da cellule quiescenti, piuttosto che la divisione, le cellule danneggiate o apoptotiche 20,24.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo S. Jinks Robertson e E. Heidenreich per la fornitura di plasmidi e di ceppi di lievito; P. Pham e MF Goodman per il saggio di aiutare withthe TLS. Questo lavoro è stato finanziato, in parte, dalla Federazione americana per la ricerca Invecchiamento concessione e dal NIH AG20642, AG025135.
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