Summary

La administración subcutánea de antagonistas muscarínicos y Triple-inmunotinción del músculo largo del elevador del Auris en ratones

Published: September 08, 2011
doi:

Summary

Se describen los procedimientos para la administración repetida de los inhibidores de la señalización de receptores muscarínicos a la largo del músculo elevador del auris (LAL) del músculo de los ratones adultos jóvenes y de inmunotinción posterior de sus uniones neuromusculares (NMJs) en wholemounts. El músculo LAL tiene ventajas únicas para revelar<em> In vivo</em> Efectos farmacológicos en NMJs.

Abstract

Los músculos de las extremidades traseras de los roedores, tales como gemelos y el músculo tibial anterior, se utilizan con frecuencia en los estudios farmacológicos in vivo de las señales esenciales para la formación y el mantenimiento de NMJs mamíferos. Sin embargo, la penetración del fármaco en estos músculos después de la administración subcutánea o intramuscular es a menudo incompleta o irregular y muchas NMJs puede quedar afectada. Aunque la administración sistémica con dispositivos tales como mini-bombas se pueden mejorar los efectos espacio-temporales, la naturaleza invasiva de este método puede causar confusión respuestas inflamatorias y / o daño muscular directo. Además, el análisis completo de la NMJs en un músculo extremidades posteriores es un reto porque requiere mucho tiempo de seccionamiento de serie y la inmunotinción extensa.

La LAL del ratón es una hoja delgada y plana de músculo que se encuentra superficialmente en el dorso del cuello. Es un músculo de contracción rápida que funciona para mover el pabellón de la oreja. Que contiene partes rostral y caudal que se originan en la línea media del cráneo y se extienden lateralmente a la porción cartilaginosa de cada pabellón. El músculo está inervado por una rama del nervio facial que los proyectos de caudal a medida que sale del agujero estilomastoideo. Nosotros y otros han encontrado LAL a ser una preparación útil que ofrece ventajas para la investigación de corto y largo plazo los efectos in vivo de las drogas en NMJs y los músculos. En primer lugar, su localización superficial facilita múltiples aplicaciones locales de medicamentos bajo anestesia ligera. En segundo lugar, su delgadez (2-3 capas de las fibras musculares) permite la visualización y el análisis de casi todos los NMJs dentro del músculo. En tercer lugar, la facilidad de disección con su nervio intacto, junto con el patrón de su inervación permite el análisis complementario electrofisiológicos in vitro 9,5. Por último, y quizás lo más importante, una pequeña cantidad aplicada (~ 50μl) fácilmente cubre la superficie del músculo entero, ofrece una exposición uniforme y prolongada de todas sus NMJs a la droga y elimina la necesidad de un enfoque sistémico 1,8.

Protocol

1. La administración subcutánea de receptor de acetilcolina muscarínicos (mAChR) antagonistas Preparar en condiciones asépticas, la dosis apropiada de antagonista mAChR, (cf. cuadro) mediante la disolución del fármaco en solución salina fisiológica estéril en el tubo de reacción de 1,5 ml. Los antagonistas se utilizaron los siguientes: atropina, methoctramina, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7. Dibuja 50μl de solución en jeringa de insulina a1cc y usar una jeringa para cada ratón. Tambi?…

Discussion

El método aquí presentado permite la investigación de los roles previamente no reconocido de los subtipos específicos mAChR de señalización en la estabilidad y el mantenimiento de NMJs mamíferos. Este método también será útil para probar los efectos de los factores neurotróficos y agentes farmacológicos. Por ejemplo, nuestro laboratorio encontró que el factor neurotrófico ciliar (CNTF) provocó brotes de casi todas las terminales nerviosas en ratones adultos LAL 1 . Este resultado contrasta con est…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Asociación de Distrofia Muscular, el NIH (NS062320).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
ketamine Hospira NDC0409-2051-05 Dose: 120mg/kg
xylazine Lloyd Laboratories LA33806 Dose: 8mg/kg
atropine Sigma-Aldrich A0132 (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg – 20mg/kg
atropine Voigt Global Distribution AT105 Pharmaceutical grade
Methoctramine Sigma-Aldrich M105 Dose: 100 – 400M
4-DAMP Sigma-Aldrich D142 Dose: 2.5mg/kg
AFDX-116 Tocris Bioscience 1105 250M
AFDX-384 Tocris Bioscience 1345 50M – 500M
MT 7 Peptides International PMT-4340-s 0.1M – 1M
1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 Invitrogen 10010049  
Paraformaldehyde Fisher T353-500 Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4
Sodium pentobarbitol Virbac Animal Health NDC-051311-050-01 Dose: 390mg/kg
Sylgard Dow Corning Part # 184 Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs
0.1M Glycine Sigma-Aldrich G-7126 Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS
2% Bovine serum albumin (2% BSA) Sigma-Aldrich A3059-100g Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS
0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) Sigma-Aldrich T9284-100mL Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS
α-bungarotoxin Invitrogen T1175 Use at concentration of 1:200
SMI-312 Sternberger Monoclonals SMI312 Use at concentration of 1:1000
SV2 Developmental Studies Hybridoma Bank SV2-Supernatant Use at concentration of 1:10
S100 Dako Z0311 Use at concentration of 1:400
FITC- goat anti-mouse IgG1 Roche 03117731001 Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400
Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit Invitrogen A21244 Use at concentration of 1:200
Vectashield fluorescent mounting media Vector laboratories H-1000 This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish.
Small Spring Scissors Fine Science Tools 15002-08  
Dissection forceps Fine Science Tools 11295-51  

References

  1. Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
  2. Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).
  3. Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).
  4. Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses. J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).
  5. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
  6. Lanuza, M. A. Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase. C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).
  7. Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
  8. Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
  9. Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
  10. Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
  11. Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
  12. Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
  13. Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).

Play Video

Cite This Article
Wright, M., Kim, A., Son, Y. Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice. J. Vis. Exp. (55), e3124, doi:10.3791/3124 (2011).

View Video