Descrevemos os procedimentos para a administração repetida de inibidores da sinalização muscarínicos ao longus levantador auris (LAL) muscular de ratos adultos jovens e para a imunocoloração subseqüente de sua junções neuromusculares (NMJs) em wholemounts. O músculo LAL tem vantagens exclusivas para revelar In vivo Efeitos farmacológicos NMJs.
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Artigo de método
A administração subcutânea de antagonistas muscarínicos e Triple-A imunocoloração do músculo Longus Levator Auris em Ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Músculos dos membros posteriores de roedores, como o gastrocnêmio e tibial anterior, são freqüentemente usados para estudos farmacológicos in vivo dos sinais essenciais para a formação e manutenção de NMJs mamíferos. No entanto, a penetração de drogas para esses músculos após subcutânea ou intramuscular é muitas vezes incompleta ou irregular e NMJs muitos podem permanecer inalteradas. Embora a administração sistêmica com dispositivos como mini-bombas podem melhorar os efeitos espaço-temporais, a natureza invasiva deste método pode causar confusão respostas inflamatórias e / ou lesão muscular direta. Além disso, a análise completa do NMJs em um músculo dos membros posteriores é desafiador porque requer demorado seccionamento serial e imunocoloração extensiva.
A LAL mouse é uma folha, fino e liso do músculo localizado superficialmente no dorso do pescoço. É um músculo de contração rápida, que funciona para mover o pavilhão auricular. Ele contém porções rostral e caudal que se originam a partir da linha média do crânio e se estendem lateralmente à porção cartilaginosa de cada pavilhão. O músculo é fornecida por um ramo do nervo facial que os projetos caudalmente à medida que sai do forame stylomastoid. Nós e os outros descobriram LAL ser uma preparação conveniente que oferece vantagens para a investigação de curto e longo prazo os efeitos in vivo de drogas em NMJs e músculos. Em primeiro lugar, a sua localização superficial facilita múltiplas aplicações locais de medicamentos sob anestesia luz. Segundo, sua magreza (2-3 camadas de fibras musculares) permite a visualização e análise de quase todos os NMJs dentro do músculo. Em terceiro lugar, a facilidade de dissecando-a com a sua intacta nervo, juntamente com o padrão de sua inervação permite análise suplementar eletrofisiológicos in vitro 9,5. Por último, e talvez mais importante, um pequeno volume aplicado (~ 50μl) facilmente cobre a superfície do músculo inteiro, fornece uma exposição uniforme e prolongado de todos os seus NMJs à droga e elimina a necessidade de uma abordagem sistêmica 1,8.
Protocolo
1. Administração subcutânea de acetilcolina muscarínicos receptor (mAChR) antagonistas
- Prepare sob condições assépticas, a dose apropriada de antagonista mAChR, (cf., Tabela) pela dissolução da droga no soro fisiológico estéril, em tubo de reação 1,5 ml. Os antagonistas foram utilizados os seguintes: atropina, Methoctramine, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7.
- Desenhe 50μl de solução em seringa de insulina a1cc e usar uma seringa separada para cada rato. Também preparar seringas contendo soro fisiológico apenas para cada rato no grupo controle. Manter as seringas em gelo até estar pronto para injetar.
- Anestesiar ratos com cetamina-xilazin....
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Discussão
O método aqui apresentado permite a investigação de papéis previamente não reconhecido do subtipo específico mAChR sinalização na estabilidade e manutenção de NMJs mamíferos. Este método será útil também para testar os efeitos de fatores neurotróficos e agentes farmacológicos. Por exemplo, nosso laboratório constatou que fator neurotrófico ciliar (CNTF) provocou surgimento de quase todos os terminais nervosos LAL em ratos adultos 1 . Este resultado contrasta com estudos anteriores de CNTF tratados com os músculos.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Muscular Dystrophy Association, NIH (NS062320).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| ketamina | Hospira | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xilazina | Lloyd Laboratories | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropina | Sigma-Aldrich | A0132 | (> 98% de pureza); Dose: 0.2mg/kg - 20mg/kg |
| atropina | Voigt Global Distribution | AT105 | Grau farmacêutico |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 - 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M - 500M |
| MT 7 | Peptídeos Internacional | PMT-4340-s | 0,1 M - 1M |
| Phosphate Buffered 1X pH, solução salina 7,4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldeído | Pescador | T353-500 | Faça solução a 10% no primeiro dissolvendo água deionizada 10g/100mL destilada; fazer 4% com 1X PBS, ajustar o pH para 7,4 |
| Sódio pentobarbitol | Virbac Saúde Animal | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Parte # 184 | Siga as instruções que vêm com o kit, pode usar placa de cultura múltiplas empresas (30mm, 60mm, 100mm), dependendo das necessidades |
| 0,1 M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Adicionar 0.185g de 25 ml de 2% BSA / PBS |
| 2% albumina sérica bovina (BSA 2%) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolver 2g BSA em 100mL de PBS 1X |
| X100 Triton 0,2% em 2% BSA / PBS (tampão de bloqueio) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolver 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use na concentração de 1:200 |
| SMI-312 | Monoclonais Sternberger | SMI312 | Use na concentração de 1:1000 |
| SV2 | Estudos do Banco de desenvolvimento Hibridoma | SV2-sobrenadante | Use a concentração de 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use na concentração de 1:400 |
| FITC-cabra anti-rato IgG1 | Roche | 03117731001 | Use na concentração de 1:200, mas se o fundo é alto, tente 1:400 |
| Alexa Fluor-cabra 647 conjugado anti-coelho | Invitrogen | A21244 | Use na concentração de 1:200 |
| Vectashield fluorescentes montar mídia | Vector laboratórios | H-1000 | Esta não é uma mídia de hard-set, você vai precisar para assegurar a lamínula com unhas polonês claro. |
| Tesoura pequena Primavera | Multa Ferramentas Ciência | 15002-08 | |
| Pinça de dissecção | Multa Ferramentas Ciência | 11295-51 |
Referências
- Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
- Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y.
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Reimpressões e permissões
