Summary
Descrevemos os procedimentos para a administração repetida de inibidores da sinalização muscarínicos ao longus levantador auris (LAL) muscular de ratos adultos jovens e para a imunocoloração subseqüente de sua junções neuromusculares (NMJs) em wholemounts. O músculo LAL tem vantagens exclusivas para revelar
Abstract
Músculos dos membros posteriores de roedores, como o gastrocnêmio e tibial anterior, são freqüentemente usados para estudos farmacológicos in vivo dos sinais essenciais para a formação e manutenção de NMJs mamíferos. No entanto, a penetração de drogas para esses músculos após subcutânea ou intramuscular é muitas vezes incompleta ou irregular e NMJs muitos podem permanecer inalteradas. Embora a administração sistêmica com dispositivos como mini-bombas podem melhorar os efeitos espaço-temporais, a natureza invasiva deste método pode causar confusão respostas inflamatórias e / ou lesão muscular direta. Além disso, a análise completa do NMJs em um músculo dos membros posteriores é desafiador porque requer demorado seccionamento serial e imunocoloração extensiva.
A LAL mouse é uma folha, fino e liso do músculo localizado superficialmente no dorso do pescoço. É um músculo de contração rápida, que funciona para mover o pavilhão auricular. Ele contém porções rostral e caudal que se originam a partir da linha média do crânio e se estendem lateralmente à porção cartilaginosa de cada pavilhão. O músculo é fornecida por um ramo do nervo facial que os projetos caudalmente à medida que sai do forame stylomastoid. Nós e os outros descobriram LAL ser uma preparação conveniente que oferece vantagens para a investigação de curto e longo prazo os efeitos in vivo de drogas em NMJs e músculos. Em primeiro lugar, a sua localização superficial facilita múltiplas aplicações locais de medicamentos sob anestesia luz. Segundo, sua magreza (2-3 camadas de fibras musculares) permite a visualização e análise de quase todos os NMJs dentro do músculo. Em terceiro lugar, a facilidade de dissecando-a com a sua intacta nervo, juntamente com o padrão de sua inervação permite análise suplementar eletrofisiológicos in vitro 9,5. Por último, e talvez mais importante, um pequeno volume aplicado (~ 50μl) facilmente cobre a superfície do músculo inteiro, fornece uma exposição uniforme e prolongado de todos os seus NMJs à droga e elimina a necessidade de uma abordagem sistêmica 1,8.
Protocol
1. Administração subcutânea de acetilcolina muscarínicos receptor (mAChR) antagonistas
- Prepare sob condições assépticas, a dose apropriada de antagonista mAChR, (cf., Tabela) pela dissolução da droga no soro fisiológico estéril, em tubo de reação 1,5 ml. Os antagonistas foram utilizados os seguintes: atropina, Methoctramine, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7.
- Desenhe 50μl de solução em seringa de insulina a1cc e usar uma seringa separada para cada rato. Também preparar seringas contendo soro fisiológico apenas para cada rato no grupo controle. Manter as seringas em gelo até estar pronto para injetar.
- Anestesiar ratos com cetamina-xilazina cocktail (120 mg / kg de cetamina, 8 mg / kg de xilazina) Verifique se há profundidade anestésica adequada, observando a falta de resposta aos pés pinch.
- Após a sedação adequada, raspar o cabelo que cobre a região rostral da cabeça até a região caudal do pescoço, limpe restantes cabelo longe com etanol 70%.
- Rato lugar sob estereomicroscópio, e inserir agulha, paralelamente ao músculo LAL enquanto puxa levemente a agulha da seringa (Fig. 1A, B). Isso garante que a agulha é introduzida na sobrejacente tecido conjuntivo e não diretamente danificar o músculo LAL em si. Inserir a agulha de modo que a ponta abrange o aspecto caudal do músculo LAL.
- Muito lentamente, começam a injectar a solução sobre o músculo direito LAL ao retirar a seringa, o tempo de injeção total deve ser de aproximadamente 1 minuto. Se injetado corretamente, a solução deve formar uma "cúpula" que é de aproximadamente 1 cm de diâmetro, na pele sobrejacente que permanecerá por pelo menos uma hora. Uma solução uniformemente injetados cobrirá a regiões inteiras rostral e caudal do músculo direito LAL.
- Repita o procedimento a cada 12 horas por 1-7 dias. Para outros estudos1, foi utilizado o mesmo protocolo para injetar fatores de crescimento a cada 12 horas para até 21 dias. Sem respostas anormais foram observados em ratos administrados com anestesia 2x por dia por até 21 dias.
2. Dissecação dos músculos LAL
- Euthanize camundongos com uma overdose de pentobarbital sódico (390 mg / kg). A morte é assegurada por avaliar a falta de batimentos cardíacos após a toracotomia é realizada.
- Pino para baixo com o mouse em um prato de dissecação, face dorsal com 1 pino em cada pata e um pino através do nariz.
- Fazer a primeira incisão através da pele apenas com uma tesoura pequena mola para cortar ao longo da LAL esquerda da região proximal apenas para o ouvido para a região em torno do ombro esquerdo.
- Remova cuidadosamente a pele nesta região, mas evitar o corte muito perto da orelha direita como este é um dos pontos de fixação para o músculo direito LAL.
- Localize a faixa de tecido adiposo centralmente posicionado de lipídios ao longo da linha média, na superfície superficial da cabeça, onde os músculos direito e esquerdo LAL se encontram. Com uma tesoura pequena mola, corte 1 centímetro à direita do tecido adiposo (em direção à orelha esquerda) da borda proximal do músculo esquerdo LAL até atingir o ombro (Fig. 1C).
- Uma vez que a incisão é feita, casca de volta o direito LAL músculo com uma pinça pequena para expor o lado ventral do músculo. Caimento do tecido conjuntivo e fáscia, enquanto cuidadosamente puxando para cima no músculo direito LAL com uma pinça (Fig. 1C).
- Corte em torno da extremidade caudal da LAL direita na base da orelha. Continue cortando, movendo-se para o final rostral da orelha direita, mantendo a LAL direito virado (Fig. 1C).. É melhor incluir mais tecido nesta etapa do que o risco de danificar o LAL em si. Se o músculo começa a secar, pipeta 1X PBS sobre o músculo.
- Lugar dissecados direito LAL em 30 milímetros prato de cultura contendo Sylgard 1X PBS, lado dorsal para cima. Pino para baixo quatro cantos do músculo com pinos pequeno inseto.
- Utilizando uma pinça e tesouras pequenas primavera, tecido conjuntivo limpa das superfícies dorsal e ventral do músculo direito LAL. Vire muscular durante e re-pin, a fim de limpar superfície ventral. 03/02 músculos podem ser colocados no mesmo prato 30mm.
3. Imunocoloração triplo da NMJs LAL: Dia 1
- Antes de imunocoloração início, prepare todos os reagentes necessários. 1X PBS, 2% BSA soro albumina bovina) / PBS, 0,1 M Glycine em 2% BSA / PBS, X100 Triton 0,2% em 2% BSA / PBS e paraformaldeído a 4% (PFA) em 1X PBS serão necessários. Pré-cool metanol no freezer -20 C °.
- Deixe os músculos LAL preso no lado dorsal prato durante este processo. Descartar 1X solução PBS e adicione o suficiente 4% (PFA) para cobrir o músculo. Prato lugar em shaker à velocidade de 2 ou 3 por 20 minutos. Salvo disposição em contrário, o prato deve ser colocado em um agitador para as etapas seguintes.
- Descartar PFA 4% e lavar o músculo com 1X PBS três vezes, 10 'cada.
- Descartar última 1X PBS lavar e adicionar 0,1 M Glycine em 2% BSA / PBS solução para 30 '.
- Descartar 0,1 M solução Glycine umd adicionar 1X PBS contendo rodamina conjugado α bungarotoxin-a uma concentração de 1:200 por 15 '.
- Descartar α bungarotoxin solução e lavar muscular em 1X PBS, 3 vezes 10 'cada.
- Permeabilizar o tecido adicionando pré-resfriado metanol e colocar o prato no freezer -20 ° C para precisamente cinco minutos, sem agitação necessária.
- Remover o metanol e lavar 3 vezes 10 'cada um com 1X PBS. Descartar última lavagem e tecido bloco com 0,2% de triton X-100 em 2% BSA / PBS por 1 hora. Os passos de lavagem e bloqueio são realizados à temperatura ambiente.
- Incubar os músculos durante a noite, agitando, a 4 ° C em um coquetel de anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio (cf., Tabela).
4. Imunocoloração triplo da NMJs LAL: Dia 2
- Lavar os músculos em 1X PBS 3 vezes, 10 'cada, à temperatura ambiente.
- Adicionar coquetel de anticorpos secundários em solução de bloqueio por 1 hora à temperatura ambiente (cf., Tabela). Os músculos devem ser protegidos da luz a partir desse passo para prevenir foto-branqueamento de Alexa Fluor-fluorescência 647.
- Lavar os músculos em 1X PBS 3 vezes, 10 'cada.
- Limpe qualquer tecido conjuntivo restantes em 1X PBS, corte as bordas laterais dos músculos LAL e montagem em lâminas lado dorsal para cima, utilizando tampa de vidro-escorrega e meios de montagem. Use claro unha polonês para garantir lamínula no lugar.
- Slides proteger da luz e armazenar a -20 ° C até que esteja pronto para análise.
5. Imagem confocal de NMJs LAL
- Imagens de alta resolução confocal são obtidos com um Plano de Apo Leica objetivo de petróleo 63X (1.4NA) em um microscópio Leica TCS 4D confocal.
- Fluoresceína e Alexa 647 sinais foram digitalizados com simultaneamente linhas de laser 488 nm (Argon, 488 nm, 20 mW) e 633 nm (HeNe, 633 nm, 10 mW), respectivamente. Seqüencialmente, o sinal é então digitalizado Rodamina com a linha do laser 561 nm (DPSS, 561, 20 mW). Secções ópticas foram coletadas em intervalos de 0,3 micrômetros, o número de imagens no plano z variados 60-80. O pinhole é ajustado para 1 Airy (107,97 um). O formato de imagem 1024 x 1024 (X, Y), com um factor de zoom de 1, resultados de velocidade de 400Hz em uma imagem de tamanho M 234,32 x 234,32 mm e tamanho de pixel de 229,05 nm x 229,05 nm.
- Leica software de aquisição TCS-NT é então usado para reconstruir z-series imagens em projeções de intensidade máxima.
- Multipanel imagens são ajustados para o brilho eo contraste usando o Adobe Photoshop.
- Para um músculo típico LAL, deve ser capaz de analisar cerca de 75-100 NMJs rosto en. Estabilidade sináptica é determinada por características tais como o alinhamento espacial de pré-, peri-e pós-sináptico elementos (ie, nervosas, células de Schwann e muscular), e as medições da área sináptica (isto é, o tamanho sinapse).
Resultados representativos:
No MNJ mamíferos adultos, um axônio único motor elabora galhos finos que forma altamente diferenciada mandris de um terminal nervoso (Fig. 2; Green) em uma única fibra muscular, precisamente apposed a clusters de pós-sinápticos AChRs nicotínico (Fig. 2; Red) . Perisynaptically, as células de Schwann terminal cobrir bem todos os ramos de terminações nervosas pré-sinápticas (Fig. 2; Azul). A integridade estrutural e funcional desta organização tripartite é gravemente perturbada pela aplicação diária de inibidores subtipo específico mAChR. No exemplo aqui apresentado (Fig. 3), 4-DAMP, um antagonista mAChR com alta afinidade para o M1, M3, M4 e M5 subtipos mAChR, evoca eliminação seletiva de terminais nervosos da NMJs numerosos em toda a superfície do músculo (Fig. 3B, C). Além disso, as células de Schwann terminal são anormalmente quiescente 8, como evidenciado pela rotulagem S100 brilhante sem extensão do processo (Fig. 3B ", 3C"). Pós-sinapticamente, as fibras musculares são normais e não há perda de nAChRs (Fig. 3B, 3C).
Figura 1. Localização anatômica e organização do músculo LAL. Localização da rostral (rLAL), caudal (CLAL), e do nervo LAL (LALn) e placa terminal bandas correspondentes são mostradas (A, inset). A localização e orientação da agulha em relação ao músculo LAL é mostrado para o procedimento de injeção (B). Pontos de incisão são mostradas para o procedimento de dissecção (C).
Figura 2. Tripartite organização do MNJ. Ampliação de alta vista confocal de um MNJ mouse. Um único axônio elabora ramos terminais finos (A), hermeticamente fechados por terminal de células de Schwann e seus processos (A ', ponto de asteriscos para corpos celulares terminal Schwann). Pós-sinapticamente em uma fibra muscular, um grupo de AChRs nicotínico é precisamente apposed aos ramos terminais do nervonais e células de Schwann terminal.
Figura 3. LAL músculos tratados com 4-DAMP, um antagonista mAChR. Baixa e de alta ampliação visualizações confocal de músculos LAL tratados com veículo ou 4-DAMP. Em contraste com o músculo veículo-tratados (A-A NMJs'''), numerosos no 4-DAMP tratados muscular terminais falta do nervo (B-B''', C-C'''). A área de box na Figura 2B é ampliado na Figura 2C.
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Discussion
O método aqui apresentado permite a investigação de papéis previamente não reconhecido do subtipo específico mAChR sinalização na estabilidade e manutenção de NMJs mamíferos. Este método será útil também para testar os efeitos de fatores neurotróficos e agentes farmacológicos. Por exemplo, nosso laboratório constatou que fator neurotrófico ciliar (CNTF) provocou surgimento de quase todos os terminais nervosos LAL em ratos adultos 1 . Este resultado contrasta com estudos anteriores de CNTF tratados com os músculos dos membros posteriores, que relatou moderada brotando em ca. 13-33% do glúteo e em 9% dos laterais gastrocnêmio cruzamentos 3. Acreditamos que a discrepância foi devido à exposição mais uniforme e prolongado dos terminais nervosos para CNTF no LAL do que nos músculos dos membros posteriores. De fato, quando nós aplicamos a CNTF gastrocnêmio lateral e tibial anterior músculos usando o mesmo protocolo que provocou surgimento generalizado de quase todos os NMJs LAL, observamos sprouting fraco de apenas um número modesto de NMJs que foi localizado preferencialmente perto dos locais de injeção. Aparentemente, a exposição da NMJs hindlimb para CNTF foram limitados e desiguais, como também observou em um estudo anterior 2 . Por outro lado, CNTF injetado entre o tecido conjuntivo subcutâneo e da fáscia LAL, mas não CNTF administrado por via subcutânea nos músculos dos membros posteriores, formou um inchaço local, subdérmico que persistiu por pelo menos uma hora antes vascular reabsorção. Também é notável que mesmo quando a freqüência de injeção de antagonistas CNFT ou mAChR foi aumentada para até quatro vezes por dia, não observamos efeitos particularmente aditivo de antagonistas CNTF e mAChR. Além disso, se o procedimento de injeção é realizado adequadamente, é improvável que qualquer lesão muscular direta iria ocorrer. No entanto, se fez um dano no músculo durante o processo de injeção, brotamento axonal no terminal do nervo ou nos nós, e / ou degeneração da fibra muscular pode ser observado 1,8. Em resumo, os músculos LAL são uma preparação única que permite a exposição uniforme e prolongado de todos os NMJs dentro de um músculo com procedimentos relativamente fácil e rápida.
Quanto mais estreita porção caudal do músculo LAL é mais espessa (3-5 fibras musculares de espessura) que a maior parte rostral (2-3 fibra muscular de espessura). Assim, NMJs associadas com as fibras musculares profundamente posicionado no caudal LAL freqüentemente não são rotulados de imunocoloração wholemount ou rotulados apenas por α bungarotoxin, que penetra mais profundamente do que os anticorpos devido ao seu menor tamanho e alta afinidade para nAChRs. Estes NMJs pode ser mal interpretada como tendo terminais nervosos perdidos ou células de Schwann, devido aos efeitos específicos das drogas aplicadas. Portanto, é importante observar se esses cruzamentos são apenas observados em LAL caudal, e se o NMJs ou fibras musculares são superficialmente ou profundamente posicionado: fibras musculares superficialmente posicionados são normalmente associados com imunofluorescência de fundo muito mais elevado do que as fibras profundamente posicionado. Alternativamente, pode-se omitir NMJs profundamente posicionado na faixa caudal do LAL da análise wholemount.
Apesar de transecção completa de nervos LAL é relativamente fácil e permitiu-nos estudar os efeitos de inibição mAChR em músculos desnervados, o tamanho ea acessibilidade dos nervos LAL limitar os tipos de abordagens cirúrgicas que podem ser investigados. Por exemplo, danificando parcialmente nervo LAL, a fim de induzir a denervação parcial de um músculo LAL parece tecnicamente bastante desafiador.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Muscular Dystrophy Association, NIH (NS062320).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ketamine | Hospira Inc. | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd, Inc. | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg — 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 - 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M - 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M - 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche Group | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector Laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
References
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