Summary
Nous décrivons les procédures de l'administration répétée d'inhibiteurs de la signalisation muscariniques à l'longus releveur Auris (LAL) de muscle de souris adultes jeunes et d'immunomarquage ultérieure de ses jonctions neuromusculaires (NMJs) dans des échantillons entiers. Le muscle a des avantages uniques du labo pour révéler
Abstract
Muscles des membres postérieurs des rongeurs, comme les gastrocnémiens et du jambier antérieur, sont fréquemment utilisés pour les études pharmacologiques in vivo des signaux essentiels pour la formation et la maintenance de NMJs mammifères. Cependant, la pénétration du médicament dans ces muscles sous-cutanée ou intramusculaire est souvent incomplète ou inégale et de nombreuses NMJs peut rester inchangée. Bien que l'administration systémique de dispositifs tels que des mini-pompes peuvent améliorer les effets spatio-temporelle, le caractère invasif de cette approche peut entraîner de confusion réponses inflammatoires et / ou des dommages musculaires directes. Par ailleurs, l'analyse complète de la NMJs dans un muscle du membre postérieur est difficile car elle nécessite beaucoup de temps coupes sériées et immunomarquage vaste.
Le labo de la souris est une fine feuille plate de muscle situé superficiellement sur le dos de la nuque. C'est un tic musculaire rapide que les fonctions pour déplacer le pavillon de l'oreille. Il contient des portions rostrales et caudales qui proviennent de la ligne médiane du crâne et s'étendent latéralement à la partie cartilagineuse de chaque penne. Le muscle est innervé par une branche du nerf facial que les projets caudalement à sa sortie du trou stylo-mastoïdien. Nous et d'autres ont trouvé du labo pour être une préparation pratique qui offre des avantages pour l'enquête des deux courts et à long terme les effets in vivo de médicaments sur NMJs et les muscles. Tout d'abord, sa localisation superficielle facilite multiples applications locale de médicaments sous anesthésie légère. Deuxièmement, sa minceur (2-3 couches de fibres musculaires) permet la visualisation et l'analyse de presque tous les NMJs dans le muscle. Troisièmement, la facilité de le disséquer avec ses nerfs intacts avec le modèle de son innervation permet une analyse supplémentaire électrophysiologiques in vitro de 9,5. Enfin, et surtout, un petit volume appliqué (~ 50 pl) couvre facilement la surface du muscle entier, offre une exposition uniforme et prolongée de tous ses NMJs à la drogue et élimine la nécessité d'une approche systémique 1,8.
Protocol
1. Administration sous-cutanée du récepteur de l'acétylcholine muscariniques (mAChR) antagonistes
- Préparer dans des conditions aseptiques la dose appropriée de l'antagoniste mAChR, (cf. tableau) en dissolvant le médicament dans du sérum physiologique stérile dans le tube de réaction 1.5ml. Les antagonistes suivants ont été utilisés: l'atropine, méthoctramine, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7.
- Tirage 50 pl de la solution dans la seringue d'insuline et de a1cc utiliser une seringue pour chaque souris. Également préparer les seringues contenant du sérum physiologique seulement pour chaque souris du groupe contrôle. Tenez les seringues sur la glace jusqu'à ce que prêt à injecter.
- Anesthetize souris avec de la kétamine-xylazine cocktails (120 mg / kg de kétamine, de 8 mg / kg de xylazine) Vérifier profondeur de l'anesthésie appropriée en observant l'absence de réponse à l'orteil de pincement.
- Après une sédation adéquate, raser les poils couvrant la région rostrale de la tête à la région caudale du cou, essuyez restantes cheveux loin avec de l'éthanol à 70%.
- Placez la souris sous stéréomicroscope, et d'insérer l'aiguille parallèlement au muscle LAL tout en tirant légèrement sur l'aiguille de la seringue (Fig. 1A, B). Cela garantit que l'aiguille est insérée dans le tissu conjonctif recouvrant et ne pas directement endommager le muscle du labo lui-même. Insérez l'aiguille pour que la pointe couvre la partie caudale du muscle LAL.
- Très lentement commencer à injecter la solution sur le muscle droit LAL tout en retirant la seringue, le temps d'injection totale devrait être d'environ 1 minute. Si elle est injectée correctement, la solution doit former un «dôme» qui est d'environ 1 cm de diamètre, dans la peau recouvrant qui restera pour au moins une heure. Une solution uniforme injecté couvrira les régions entières rostrale et caudale du muscle droit LAL.
- Répétez la procédure toutes les 12 heures pour 1 à 7 jours. Pour d'autres études1, nous avons utilisé le même protocole d'injecter des facteurs de croissance toutes les 12 heures pour un maximum de 21 jours. Aucune des réponses anormales ont été observées chez des souris administré une anesthésie avec 2x par jour pour un maximum de 21 jours.
2. Dissection des muscles du labo
- Euthanasier les souris avec une surdose de pentobarbital de sodium (390 mg / kg). La mort est assurée en évaluant le manque de rythme cardiaque, après thoracotomie est réalisée.
- Pin bas de la souris dans un plat de dissection, face dorsale avec une épingle dans chaque patte et une aiguille à travers le nez.
- Faire la première incision dans la peau uniquement, en utilisant des ciseaux pour couper petit ressort le long de la LAL à gauche de la région juste en amont de l'oreille à la région autour de l'omoplate gauche.
- Retirer délicatement la peau de cette région, mais évitez de couper trop près de l'oreille droite comme cela est l'un des points de fixation pour le muscle droit LAL.
- Repérez la bande adipeux en position centrale tissu de lipides le long de la ligne médiane, sur la surface superficielle de la tête, où les muscles droit et gauche du labo rencontrer. Avec des ciseaux petit ressort, couper 1 cm sur la droite du tissu adipeux (vers l'oreille gauche) à partir du bord proximal du muscle gauche LAL jusqu'à atteindre l'épaule (Fig. 1C).
- Une fois l'incision est faite, peler le muscle droit LAL avec petits forceps pour exposer la face ventrale du muscle. Coupez le tissu conjonctif et fascia tandis tirant doucement sur le muscle droit LAL avec une pince (Fig. 1C).
- Couper autour l'extrémité caudale du LAL à droite à la base de l'oreille. Continuer la coupe, le déplacement vers la fin rostrale de l'oreille droite, en gardant le droit de LAL remis (Fig. 1C).. Il est préférable d'inclure plus de tissu à ce stade que de risquer d'endommager le labo lui-même. Si le muscle commence à sécher, une pipette PBS 1X sur le muscle.
- Placez disséqué droit LAL dans la culture plat 30mm Sylgard contenant du PBS 1X, face dorsale en place. Pin bas des quatre coins de muscles avec des épingles petit insecte.
- En utilisant des pinces et ciseaux petits au printemps, nettoyez le tissu conjonctif des surfaces dorsale et ventrale du muscle droit LAL. Tournez musculaire plus et re-broches en vue de nettoyer la surface ventrale. 2-3 muscles peuvent être placés dans le même plat de 30mm.
3. Immunomarquage Triple NMJs LAL: Jour 1
- Avant immunomarquage début, préparer tous les réactifs nécessaires. PBS 1X, 2% d'albumine sérique bovine BSA) / PBS, glycine 0,1 M à 2% de BSA / PBS, Triton X100 à 0,2% dans 2% BSA / PBS, et 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS 1X seront nécessaires. Pré-refroidir dans le méthanol à -20 ° C au congélateur.
- Laisser les muscles LAL épinglé dans la face dorsale vaisselle pendant ce processus. Jeter PBS 1X solution et ajouter assez de 4% (PFA) pour couvrir le muscle. Placer sur agitateur plat à la vitesse de 2 ou 3 pendant 20 minutes. Sauf mention contraire, le plat doit être placé sur un agitateur pour les étapes suivantes.
- Jeter 4% PFA et laver le muscle avec du PBS 1X 3 fois, 10 'chacune.
- Jeter dernière PBS 1X laver et ajoutez 0,1 M glycine dans 2% BSA / PBS solution pendant 30 '.
- Jeter une solution de glycine 0,1 MD Ajouter du PBS 1X contenant rhodamine conjugué α-bungarotoxine à une concentration de 1:200 pendant 15 '.
- Jeter α-bungarotoxine solution et laver les muscles dans du PBS 1X, 3 fois 10 'chacune.
- Perméabiliser les tissus en y ajoutant de pré-refroidissement du méthanol et de placer le plat au congélateur à -20 ° C pendant exactement 5 minutes, sans secousses nécessaires.
- Retirez le méthanol et laver 3 fois 10 'chacun avec du PBS 1X. Jeter dernier lavage et les tissus bloc avec 0,2% de Triton X-100 dans 2% BSA / PBS pendant 1 heure. Les étapes de lavage et de blocage sont réalisées à température ambiante.
- Incuber les muscles durant la nuit, en secouant, à 4 ° C dans un cocktail d'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage (cf. tableau).
4. Immunomarquage Triple NMJs LAL: Jour 2
- Lavez les muscles dans du PBS 1X 3 fois, 10 'chacun à température ambiante.
- Ajouter cocktail d'anticorps secondaires dans une solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante (cf. tableau). Les muscles doivent être protégés de la lumière à partir de ce pas pour éviter la photo-blanchiment d'Alexa Fluor 647-fluorescence.
- Lavez les muscles dans du PBS 1X 3 fois, 10 'chacune.
- Nettoyez tout tissu conjonctif reste dans du PBS 1X, couper les bords latéraux des muscles du labo et monter sur des lames côté dorsal, en utilisant des lamelles de verre et de milieux de montage. Utilisez vernis à ongles transparent pour sécuriser lamelle en place.
- Protéger les diapositives de la lumière et conserver à -20 ° C jusqu'au moment de l'analyse.
5. Imagerie confocale des NMJs LAL
- Des images haute résolution confocales sont obtenus avec un objectif Leica Apo plan d'huile 63X (1.4NA) sur un microscope Leica TCS 4D confocale.
- Fluorescéine et Alexa 647 signaux ont été simultanément numérisées avec des lignes laser à 488 nm (argon, 488 nm, 20 mW) et 633 nm (HeNe, 633 nm, 10 mW), respectivement. En séquentiel, le signal de la rhodamine est ensuite scanné avec la ligne laser 561 nm (DPSS, 561, 20 mW). Sections optiques ont été recueillis à intervalles de 0,3 um, et le nombre d'images dans le plan z varie de 60-80. Le sténopé est ajusté à 1 Airy (107,97 UM). Le format d'image 1024 x 1024 (X, Y), avec un facteur de zoom de 1, à la vitesse des résultats 400Hz dans une taille d'image de 234,32 x 234,32 um um et la taille de pixel de 229,05 nm x 229,05 nm.
- Logiciel Leica TCS-NT d'acquisition est alors utilisé pour reconstruire des images de la série Z dans les projections d'intensité maximale.
- Multipanel images sont ajuster la luminosité et contraste à l'aide d'Adobe Photoshop.
- Pour un muscle typiques du labo, on devrait être capable d'analyser environ 75 à 100 fr NMJs visage. La stabilité Synaptic est déterminé par des caractéristiques telles que l'alignement spatial de pré-, péri-et post-synaptiques éléments (par exemple, nerveuses, des cellules de Schwann et les muscles), et les mesures de la zone synaptique (ie, la taille des synapses).
Les résultats représentatifs:
Lors de la JNM mammifères adultes, un seul axone moteur développe des branches fines qui forme hautement différenciés tonnelles d'une terminaison nerveuse (fig. 2; vert) sur une fibre musculaire, précisément revêtue de grappes postsynaptique de AChR nicotinique (Fig. 2; Rouge) . Perisynaptically, le terminal des cellules de Schwann étroitement couvrent toutes les branches de terminaisons nerveuses présynaptiques (Fig. 2; Bleu). L'intégrité structurale et fonctionnelle de cette organisation tripartite est gravement perturbée par l'application quotidienne d'inhibiteurs mAChR sous-type spécifique. Dans l'exemple présenté ici (fig. 3), 4-humide, un antagoniste du mAChR avec une haute affinité pour les autoroutes M1, M3, M4 et M5 sous-types mAChR, évoque l'élimination sélective des terminaisons nerveuses du NMJs nombreuses sur toute la surface du muscle (figure 3B, C). En outre, le terminal des cellules de Schwann sont anormalement tranquilles 8 comme en témoigne l'étiquetage S100 lumineux sans l'extension du processus (Fig. 3B », 3C"). Postsynaptique, les fibres musculaires sont normales et il n'ya aucune perte de nAChR (figure 3B, 3C).
Figure 1. Localisation anatomique et l'organisation du muscle LAL. Lieu d'rostrale (rLAL), caudale (CLAL), et le nerf LAL (LALn) et des bandes des plateaux vertébraux correspondants sont présentés (A, en médaillon). L'emplacement et l'orientation de l'aiguille en ce qui concerne le muscle LAL est montré pour la procédure d'injection (B). Incision des points sont présentés pour la procédure de dissection (C).
Figure 2. Organisation tripartite de la JNM. Fort grossissement vues confocale d'un JNM souris. Un seul axone élabore fines branches terminales (A), bien couvert par la borne cellule de Schwann et de leurs procédés (A ', point astérisques à des organes terminaux des cellules de Schwann). Postsynaptique dans une fibre musculaire, une grappe de AChR nicotinique est précisément apposed aux branches du nerf termiNALS et terminale des cellules de Schwann.
Figure 3. Muscles LAL traités avec 4-humide, un antagoniste du mAChR. Faible et fort grossissement vues confocale des muscles LAL traités avec le véhicule ou 4-DAMP. Contrairement aux muscles traités avec le véhicule (A-A NMJs'''), nombreuses dans les terminaux des muscles 4-DAMP traités nerveuses absence (B-B''', C-C'''). Une zone encadrée dans la figure 2B est zoomée à la figure 2C.
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Discussion
La méthode présentée ici permet d'établir le rôle précédemment non reconnu de sous-type de signalisation mAChR dans la stabilité et le maintien de NMJs mammifères. Cette méthode sera également utile pour tester les effets de facteurs neurotrophiques et des agents pharmacologiques. Par exemple, notre laboratoire a révélé que le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF), a suscité la germination de presque tous les terminaisons nerveuses LAL chez la souris adulte 1 . Ce résultat contraste avec les études antérieures du CNTF traités muscles des membres postérieurs, qui a rapporté modérée germination à ca. 13-33% des fessiers et à 9% du gastrocnémien latéral jonctions 3. Nous croyons que l'écart était dû à une exposition plus uniforme et prolongée des terminaisons nerveuses au CNTF dans les LAL que dans les muscles des membres postérieurs. En effet, lorsque nous avons appliqué à la CNTF gastrocnémien latéral et jambier muscles antérieurs utilisant le même protocole qui a suscité la germination généralisée de presque tous les NMJs LAL, nous avons observé la germination faible de seulement un nombre modeste de NMJs qui a été préférentiellement situé à proximité des sites d'injection. Apparemment, l'exposition de la patte postérieure au NMJs CNTF a été limité et inégal, comme aussi noté dans une étude précédente 2 . D'autre part, le CNTF injecté entre le tissu sous-cutané conjonctif et le fascia du labo, mais pas le CNTF injection sous-cutanée dans les muscles des membres postérieurs, formé un local, un gonflement sous-cutané qui ont persisté pendant au moins une heure avant la réabsorption vasculaires. Il faut aussi noter que même lorsque la fréquence d'injection d'antagonistes ou de CNFT mAChR a été augmentée à un maximum de quatre fois par jour, nous n'avons pas observé d'effets additifs en particulier des antagonistes CNTF et mAChR. En outre, si la procédure d'injection est effectuée de façon appropriée, il est peu probable que les dommages musculaires directe aurait lieu. Toutefois, si l'on ne endommager le muscle pendant la procédure d'injection, bourgeonnement axonal à la terminaison nerveuse ou au niveau des nœuds, et / ou une dégénérescence des fibres musculaires pourrait être observée 1,8. En résumé, les muscles du labo sont une préparation exceptionnelle qui permet l'uniforme, l'exposition prolongée de tous NMJs dans un muscle avec des procédures relativement facile et rapide.
L'étroite partie caudale du muscle LAL est plus épais (3-5 fibres musculaires épaisses) que l'ensemble de la partie rostrale (2-3 fibres musculaires d'épaisseur). En conséquence, NMJs associés aux fibres musculaires profondément positionné dans caudale LAL sont souvent soit pas étiqueté immunomarquage wholemount ou étiquetés seulement par α-bungarotoxine, qui pénètrent plus profondément que les anticorps en raison de sa petite taille et de haute affinité pour les nAChR. Ces NMJs peut être interprété comme ayant des terminaisons nerveuses perdues ou les cellules de Schwann en raison d'effets spécifiques des médicaments appliqués. Il est donc important de noter que ces jonctions ne sont observées dans les LAL caudale, et si le NMJs ou les fibres musculaires sont superficiellement ou profondément positionnée: les fibres musculaires superficiellement placés sont généralement associés à immunofluorescence de fond beaucoup plus élevé que les fibres fortement positionné. Alternativement, on peut omettre NMJs profondément positionnée dans la bande caudale de la LAL de l'analyse wholemount.
Bien transsection complète de nerfs LAL est relativement facile et nous a permis d'étudier les effets d'inhibition sur les muscles dénervés mAChR, la taille et l'accessibilité des nerfs LAL limiter les types d'approches chirurgicales qui peuvent être étudiés. Par exemple, partiellement endommager nerfs LAL afin d'induire une dénervation partielle d'un muscle LAL semble techniquement très difficile.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Muscular Dystrophy Association, le NIH (NS062320).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ketamine | Hospira Inc. | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd, Inc. | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg — 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 - 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M - 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M - 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche Group | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector Laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
References
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