Summary
我们描述的毒蕈碱受体信号抑制剂反复提的Auris长肌（LAL）年轻的成年小鼠的肌肉和管理程序，其神经肌肉接头在随后的免疫wholemounts（NMJs）。鲎的肌肉已经露出独特的优势
Abstract
经常用于在哺乳动物NMJs的形成和维护必不可少的信号体内的药理研究啮齿类动物，如腓肠肌和胫前，后肢肌肉。然而，药物渗透到这些肌肉，皮下或肌肉注射后往往是不完整或不平坦的，很多NMJs可以不受影响。虽然与设备，如微型泵全身给药可改善的时空效应，这种方法的入侵性可以导致混淆的炎症反应和/或直接的肌肉损伤。此外，完整的分析后肢肌肉NMJs是具有挑战性的，因为它需要耗费时间的连续切片和广泛的免疫。
鼠标鲎是一种细长，肌肉平板位于颈部背部表面。这是一个快速肌功能移动耳廓。它包含延髓和尾鳍部分来自颅骨中线和横向延伸到每个耳廓软骨部分。肌肉是提供项目尾端，因为它退出茎乳孔面神经的一个分支。我们和其他人发现鲎是一种非常方便的准备，提供的短期和长期在体内药物的影响NMJs和肌肉的调查优势。首先，其表面的位置，方便多个本地应用程序，在浅麻醉药物。其次，它的薄（2-3层肌纤维）允许几乎所有的肌肉内NMJs的可视化和分析。第三，易于解剖与神经完好，其支配的格局， 允许在体外9,5补充电生理分析。最后，也许是最重要的是，一个小的应用量（〜50μL）轻松地覆盖了整个的肌肉表面，提供了一个其所有NMJs的统一和长时间暴露在药物和消除需要一个系统性的方法1,8。
Protocol
1。皮下给药毒蕈碱型乙酰胆碱受体拮抗剂（mAChR）
- 在无菌条件下适当的剂量，mAChR拮抗剂（参表）准备通过溶解在无菌生理盐水1.5ml的反应管中的药物。以下拮抗剂：阿托品，Methoctramine，4阻尼，AFDX - 116，AFDX - 384吨7。
- 绘制成a1cc胰岛素注射器的解决方案50μL，并为每个鼠标使用单独的注射器。还准备只包含每个对照组小鼠生理盐水的注射器。置于冰上直到准备注射器注入。
- 麻醉与氯胺酮 - 甲苯噻嗪鸡尾酒（120毫克/公斤氯胺酮，8毫克/公斤甲苯噻嗪）的小鼠，检查通过观察反应缺乏脚趾捏适当的麻醉深度。
- 经过适当的镇静，剃光头发覆盖喙头颈部的尾部区域地区，用70％乙醇擦拭其余头发远离。
- 体视显微镜下，放置鼠标和插入针并行鲎肌肉，而在注射器的针头（图1A，B）的轻轻拉起。这确保针头插入覆结缔组织和鲎肌肉本身并不直接损害。插入针，使针尖涵盖鲎肌肉的尾部方面。
- 非常慢慢开始注入鲎肌肉的权利的解决方案，同时撤回的注射器，注射时间应约1分钟。如果注射不当，解决方案应形成一个“巨蛋”，是直径约1厘米，上覆皮肤，将保持至少一小时。一个统一注入的解决方案将涵盖整个权鲎肌肉的喙和尾鳍地区。
- 重复步骤1至7天，每12小时。对于其他研究1，我们使用相同的协议，长达21天，每12小时注射生长因子。管理麻醉2X每天长达21天的小鼠，观察无异常反应。
2。鲎肌肉解剖
- 安乐死与小鼠过量戊巴比妥钠（390毫克/公斤）。保证评估缺乏心跳进行开胸手术后死亡。
- 拖住鼠标，在清扫菜背侧，1针，在每个爪子和1针通过鼻子。
- 只能通过皮肤的第一个切口，用小弹簧剪刀削减沿左鲎从该地区实现公正近端左肩胛骨周围地区的耳朵。
- 小心取出这区域的皮肤，但要避免过于靠近右耳切割，因为这是正确的鲎肌肉附着点之一。
- 找到中心位置的脂肪组织脂质地带沿中线，头部浅面，左，右的鲎肌肉满足。使用小弹簧剪刀，切1厘米的脂肪组织的左鲎肌肉近端边缘（向左耳）的权利，直至达到肩（ 图1C） 。
- 一旦切口，剥离回用小镊子腹侧的肌肉暴露鲎肌肉的权利。修剪的结缔组织和筋膜，一边小心翼翼地拉动右侧鲎肌肉钳（ 图 1C） 。
- 周围权鲎尾切耳基地。继续切割，走向右耳喙，保持正确的鲎打开过（图1C）。这是更好地在这一步破坏鲎本身风险包括更多的组织。如果肌肉开始，干出来的，在肌肉的吸管1X PBS。
- 解剖右鲎30毫米文化Sylgard最多包含1X PBS，背侧的菜。牵制与小虫子引脚四个角的肌肉。
- 使用权鲎肌肉背，腹表面的小镊子和春季剪刀，清洁结缔组织。转肌和重针，以清洁腹面。 2-3肌肉可能被放置在相同的30毫米菜。
3。三联免疫鲎NMJs：第1天
- 免疫开始前，准备所需的所有试剂。 1X PBS中，2％牛血清白蛋白牛血清白蛋白）/ PBS中，0.1M甘氨酸在2％BSA / PBS，0.2％，2％BSA / PBS，4％多聚甲醛（PFA）在1X PBS海卫X100将是必要的。预冷的甲醇在-20 ° C冰箱。
- 鲎肌肉固定在盘背侧在此过程中。倒掉1X PBS液和补充足够的4％（PFA）覆盖的肌肉。 20分钟，放在振动筛盘速度2或3。除非另有说明，应放在盘上的振动筛以下步骤。
- 弃掉4％PFA和用1X PBS 3次，10'每个肌肉。
- 放弃最后1X PBS清洗，并添加0.1M甘氨酸在2％的BSA / PBS液30'。
- 丢弃0.1M甘氨酸溶液D收藏1X PBS中罗丹明标记的α-银环蛇毒素在浓度为1:200 15'。
- 丢弃α-银环蛇毒素的解决方案和洗1X PBS中，3次10“每个肌肉。
- 通透组织加入预冷的甲醇和地方的菜，在-20 ° C冰箱正好是5分钟，没有晃动需要。
- 取出甲醇洗3次，10'与1X PBS。放弃最后一次洗涤与块组织0.2％Triton X - 100在2％BSA / PBS为1小时。在室温下进行洗涤和阻塞步骤。
- 过夜孵育肌肉，晃动在4 ° C在在封闭液（参表）稀释的抗体鸡尾酒。
4。三联免疫鲎NMJs：第2天
- 洗净1X PBS 3次，10“每一个在室温下的肌肉。
- 阻止在室温下1小时（参表）的解决方案中添加二级抗体鸡尾酒。这一步以后，肌肉必须得到保护，防止Alexa的福陆公司的647荧光光漂白。
- 在1X PBS 3次，10'每个洗的肌肉。
- 清洁在1X PBS任何剩余的结缔组织，切断鲎肌肉外侧边界，并安装在幻灯片背侧，用玻璃盖单和安装媒体。使用透明指甲油，以确保在地方盖滑。
- 防止光线和存储在-20 ° C，直到准备进行分析的幻灯片。
5。共焦成像鲎NMJs
- 徕卡计划阿婆63X石油客观上的Leica TCS 4D共聚焦显微镜（1.4NA）获得高分辨率的共聚焦图像。
- 荧光素和Alexa 647信号，同时扫描激光线为488 nm（氩，488纳米，20毫瓦）和633纳米（氦氖，633纳米，10毫瓦），分别。接着，若丹明信号，然后用激光线扫描561纳米（DPSS，561，20兆瓦）。光学部分，收集了0.3微米的间隔，z平面中的图像数量从60-80各不相同。针孔调整，以艾里1（107.97 UM）。图像格式为1024 × 1024（X，Y），1 234.32微米x 234.32μm和229.05 nm的像素大小x 229.05纳米的图像尺寸的400Hz的速度结果，变焦倍数。
- 徕卡TCS - NT的采集软件，然后用于重建Z系列图像到最大强度的预测。
- 多面板的图像使用Adobe Photoshop的亮度和对比度的调整。
- 对于一个典型的鲎肌肉，应该能够分析约75-100 EN面对 NMJs。是由突触稳定的功能，如前，近郊和突触后元素的空间对齐（即神经雪旺氏细胞和肌肉），和突触面积测量（即突触的大小）。
代表性的成果：
在成年哺乳动物NMJ，单一的运动神经阐述，形成高度分化的神经终端的乔木（ 图 2，绿）的罚款 树枝上的一个单一的肌肉纤维，正是apposed烟碱AChRs突触后群“（图2，红）， 。 Perisynaptically，终端雪旺氏细胞紧密包括突触前神经末梢的所有分支“（ 图 2，蓝）。这三方组织的结构和功能完整性的严重不安亚型特异性mAChR抑制剂的日常应用。在这里介绍的例子（ 图3），4潮湿，mAChR拮抗剂与货币供应量M1，M3，M4和M5 mAChR亚型高亲和力，唤起整个肌肉表面的选择性消除神经末梢（ 图 3B从众多NMJs C）。此外，终端雪旺氏细胞是异常的静态8明亮S100无过程延伸标签（ 图3B，3C“）证明。突触后，肌肉纤维是正常的，没有nAChRs的损失（图3B，3C） 。
图1。鲎肌肉的解剖位置和组织。延髓（rLAL），尾椎（cLAL），鲎神经（LALn）和相应的终板带的位置（插图）。注射过程（二）尊重鲎肌肉针的位置和方向显示。切口点解剖过程（三）所示。
图2。NMJ的三方组织。鼠标NMJ高倍率焦意见。一个单一的轴突阐述罚款终端分行（一），紧紧终端雪旺氏细胞和他们的流程（A“，星号点终端雪旺氏细胞组织）覆盖。突触后在肌纤维，烟碱AChRs集群正是apposed神经末端的分支机构nals和终端雪旺氏细胞。
图3。鲎肌肉与4潮湿，mAChR拮抗剂治疗。鲎肌肉的低和高放大倍率的焦意见处理的车辆或4潮湿。对比车辆治疗肌（A - A '''),众多NMJs 4湿热治疗肌肉缺乏神经末梢（B - B“”C - C ''').图2B中的一个盒装的面积是放大图2C。
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Discussion
这里介绍的方法，允许调查亚型特异性信号的稳定性和维护哺乳动物NMJs mAChR先前未确认的角色。此方法也将是有用的测试神经营养因子及药理制剂的影响。例如，我们的实验室发现，几乎所有的成年小鼠的鲎神经末梢引起睫状神经营养因子（CNTF ）发芽1。这与睫状神经营养因子治疗后肢肌肉，报告中度CA发芽前研究的结果对比。 13-33％的臀大肌，外侧腓肠肌路口3 9％。我们相信这种差异是由于更加均匀，长时间暴露的神经末梢比后肢肌肉鲎，CNTF。事实上，当我们应用CNTF的外侧腓肠肌和胫前肌，使用相同的协议，引起广泛的萌芽从几乎所有的鲎NMJs，我们观察到，只有适度的优先注射部位附近位于NMJs数量从弱发芽。显然，后肢NMJs暴露，CNTF已有限的和不均衡的的，在先前的研究也指出2。另一方面，睫状神经营养因子注射皮下结缔组织和鲎筋膜之间，但不CNTF的后肢肌肉皮下注入，形成了一个地方，皮下肿胀，坚持至少一小时前血管重吸收。这也是值得注意的，即使CNFT或mAChR拮抗剂注射频率增加至高达四倍的日常生活，我们没有遵守，特别是加性效应，CNTF和mAChR拮抗剂。此外，如果进行适当的注射过程，它是不太可能会发生任何直接的肌肉损伤。但是，如果一个人在注射过程中损害肌肉，神经轴突在神经终端或节点发芽，和/或肌纤维变性可观察到 1,8 。总之，鲎肌肉是一种独特的编制内的肌肉比较容易和快速的程序，允许所有NMJs均匀，长时间暴露。
一个鲎肌肉的尾部部分的窄厚于更广泛的延髓部分（厚2-3肌纤维）（3-5厚的肌肉纤维）。因此，与深深尾鳍鲎定位的肌纤维关联NMJs往往要么没有标签wholemount免疫或仅由α-银环蛇毒素，能更深刻地由于其小尺寸和高亲和力nAChRs比抗体标记。这些NMJs可以被曲解为失去的神经末梢或雪旺氏细胞，由于应用于药物的具体影响。因此重要的是要注意是否这些路口仅在尾鳍鲎的观察，是否NMJs或肌纤维的表面或深的位置：肌肉纤维表面定位通常远高于深定位纤维的背景免疫相关。另外，可以省略鲎wholemount分析尾椎地带深深定位NMJs。
鲎神经横断虽然相对容易，并允许我们研究神经支配的肌肉mAChR抑制的影响，鲎神经的大小和无障碍限制的类型的手术方法，可以进行调查。例如，部分损坏的鲎试剂，以促使一个鲎肌肉部分失神经支配的神经似乎在技术上非常有挑战性的。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作得到了肌肉萎缩症协会，国立卫生研究院（NS062320）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ketamine | Hospira Inc. | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd, Inc. | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg — 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 - 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M - 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M - 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche Group | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector Laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
References
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