Si descrivono le modalità di somministrazione ripetuta di inibitori di segnalazione muscarinici a lungo del muscolo elevatore dell'ano Auris (LAL), muscolo di topi adulti giovani e per immunocolorazione successive delle sue giunzioni neuromuscolari (NMJs) in wholemounts. Il muscolo LAL ha vantaggi unici per rivelare<em> In vivo</em> Effetti farmacologici su NMJs.
Muscoli dell'arto posteriore di roditori, come il gastrocnemio e tibiale anteriore, sono frequentemente utilizzati in vivo per studi farmacologici dei segnali indispensabili per la formazione e la manutenzione di NMJs mammiferi. Tuttavia, la penetrazione della droga in questi muscoli dopo somministrazione sottocutanea o intramuscolare è spesso incompleta o irregolare e NMJs molti possono rimanere inalterati. Sebbene la somministrazione sistemica con dispositivi come i mini-pompe in grado di migliorare gli effetti spazio-temporali, la natura invasiva di questo approccio può causare confusione risposte infiammatorie e / o danno muscolare diretto. Inoltre, l'analisi completa del NMJs in un muscolo dell'arto posteriore è impegnativo, perché richiede tempi lunghi sezionamento seriale e immunocolorazione estesa.
Il LAL mouse è un sottile foglio piatto di muscoli situati superficialmente sul dorso del collo. Si tratta di uno dei muscoli a contrazione rapida che funzioni per spostare il padiglione auricolare. Esso contiene porzioni rostrali e caudali che provengono dalla linea mediana del cranio e si estendono lateralmente alla porzione cartilaginea di ogni padiglione auricolare. Il muscolo è alimentato da un ramo del nervo facciale che i progetti caudalmente non appena esce dal forame stilo-mastoideo. Noi e altri hanno trovato LAL essere una preparazione conveniente che offre vantaggi per l'indagine sia a breve che a lungo termine in vivo gli effetti delle droghe sul NMJs e muscoli. In primo luogo, la sua posizione superficiale facilita molteplici applicazioni locali di farmaci in anestesia luce. In secondo luogo, la sua magrezza (2-3 strati di fibre muscolari) permette la visualizzazione e l'analisi di quasi tutti i NMJs all'interno del muscolo. In terzo luogo, la facilità di analizzarlo con la sua intatta nervo insieme con il modello della sua innervazione permette analisi elettrofisiologiche supplementari in vitro 9,5. Ultimo, e forse più importante, un piccolo volume applicato (~ 50μl) copre facilmente l'intera superficie muscolare, fornisce una esposizione uniforme e prolungato di tutti i suoi NMJs al farmaco ed elimina la necessità di un approccio sistemico 1,8.
The method presented here permits investigation of previously unrecognized roles of subtype-specific mAChR signaling in the stability and maintenance of mammalian NMJs. This method will also be useful to test the effects of neurotrophic factors and pharmacological agents. For example, our laboratory found that Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) elicited sprouting from nearly all LAL nerve terminals in adult mice1. This result contrasted with prior studies of CNTF-treated hind limb muscles, which reported moder…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da Distrofia Muscolare Association, NIH (NS062320).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
ketamine | Hospira | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
xylazine | Lloyd Laboratories | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg – 20mg/kg |
atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 – 400M |
4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M – 500M |
MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M – 1M |
1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
Vectashield fluorescent mounting media | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |