En hurtig og billig måde at udtrække kvalitet malaria parasitten og vektor-DNA fra myg prøver er beskrevet. Udnyttelse af chelaterende egenskaber Chelex harpiks, muliggør den enkle metode genotypebestemmelse af malariaparasitter i mosquito mid-tarm og spytkirtel faser, samt molekylær identifikation af<em> Anopheles</em> Søskende arter ved PCR.
Endemiske lande tager i stigende grad molekylære værktøjer til effektiv maskinskrivning, identifikation og overvågning mod malariaparasitter og vektor myg, som en integreret del af deres bekæmpelsesprogrammer 1,2,3,4,5. For bæredygtig etablering af disse præcise metoder i operationer forskning for at styrke malaria kontrol og eliminering indsats, enkle og overkommelige metoder, med påholdende reagens og udstyr er afgørende 6,7,8. Her præsenterer vi en simpel Chelex-baseret teknik til at udvinde malaria parasitten og vektor-DNA fra marken indsamlede myg prøver.
Vi morfologisk identificerede 72 Anopheles gambiae sl. Fra 156 myg fanget af pyrethrum spray fangster i soverum i husholdninger i en 2.000 km 2 nærhed af Malaria Institut på Macha. Efter dissektion at adskille hoved og thorax fra maven for alle 72 Anopheles GAMbiae sl. myg blev de to sektioner anbringes individuelt i 1,5 ml mikrocentrifugerør og nedsænket i 20 ul deioniseret vand. Anvendelse af en steril pipettespids blev hver mosquito afsnit separat homogeniseret til en ensartet suspension i deioniseret vand. Af den efterfølgende homogenat fra hver myg sektion, blev 10 pi bibeholdes, mens den anden 10 ul blev overført til en separat autoklaveret 1,5 ml rør. De separate portioner blev udsat for DNA ekstraktion af enten forenklede Chelex eller standarden udsaltning ekstraktionsprotokol 9,10. Den udsaltning protokollen er såkaldt og almindeligt anvendt, fordi det anvender høje saltkoncentrationer i stedet for farlige organiske opløsningsmidler (såsom phenol og chloroform) for proteinet udfældningstrin under DNA-ekstraktion 9.
Ekstrakter blev anvendt som templates til PCR-amplifikation under anvendelse af primere rettet mod arthropod mitochondrial nikotinamidadenindinucleotid dehydrogenase (NADH) subunit 4-genet (ND4) at kontrollere DNA-kvalitet 11, en PCR til identifikation af Anopheles gambiae søskende arter 10 og et nested PCR til typebestemmelse af Plasmodium falciparum-infektion 12. Sammenligning med DNA-kvalitet (ND4) PCR viste 93% følsomhed og 82% specificitet for Chelex fremgangsmåde i forhold til den etablerede udsaltning protokol. Tilsvarende værdier af følsomhed og specificitet var 100% og 78% under anvendelse af søskende artsidentifikation PCR og 92% og 80% for henholdsvis P. falciparum detektion PCR. Der var ingen signifikante forskelle i andelen af prøver, der giver amplicon signal med Chelex eller den regelmæssige udsaltnings protokol over alle tre PCR-applikationer. Den Chelex tilgang, der kræves tre simple reagenser og 37 min at udfylde, mens den udsaltnings protokol indebar 10 forskellige reagenser og 2 timer og 47 min 'behandlingstid, herunder en overnatning skridt. Vores resultater viser thved Chelex metode kan sammenlignes med de eksisterende udsaltning ekstraktion og kan være substitueret som en enkel og holdbar fremgangsmåde i ressource-begrænsede miljøer, hvor en konstant reagens forsyningskæde er ofte vanskeligt at opretholde.
Den forenklede Chelex metode præsenteres her muliggør ekstraktion af kvaliteten Anopheles spp og P. falciparum DNA fra myg prøver kan underkastes forskellige PCR-applikationer. Denne teknik kan anvendes til molekylær identifikation af malaria vektor myg og overvågning af resistente P. falciparum alleler i myg for nationale malaria kontrol programmer. Fordelene ved det forenklede Chelex teknik indbefatter enkelhed, færre reagenser og deraf følgende omkostninger, sikkerhed og kortere behandlingstid (37 min) end standard protokoller, såsom udsaltning fremgangsmåde 10 (2 hr 47 min, og en overnight trin, tabel 1). De førnævnte fordele og minimale reagens krav (3 reagenser) i forhold til den nuværende standard protokol (10 reagenser, tabel 1) 11,15, gør den forenklede Chelex protokol særlig venligt til endemiske lande laboratorier, hvor en konstant reagensforsyningskæde er ofte vanskeligt at opretholde. En begrænsning ved metoden er, at ligesom den standard protokol, det var også genstand for PCR-inhibitorer vides at forekomme i den myg integument 16. Dog er denne let afhjælpes ved optagelse af BSA i assayene. BSA er også blevet anvendt med succes som en forstærkning forstærker mod inhibitorer i andre PCR-applikationer 17,18.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne står i gæld til de høvdinge, headmen og samfund i Macha for deres unwaveing samarbejde under mosquito feltprøve samlinger. Dr. Doug Norris og Rebekka Kent tilbudt uvurderlig ekspertise på udsaltning protokollen. Dette arbejde blev finansieret af Johns Hopkins Malaria Research Institute pilot tilskud system. Mosquito og parasit-DNA laboratoriestandarder blev venligt doneret af mR4, American Type & Culture Collection.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
BSA | New England Biolabs | B9001S |