Eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, die Qualität Malariaparasiten und Vektor-DNA aus mosquito Proben zu extrahieren beschrieben. Aufbauend auf chelatisierenden Eigenschaften der Chelex Harz, ermöglicht die einfache Methode Genotypisierung von Malaria-Parasiten in Mücken Mitte Darm und Speicheldrüsen Phasen sowie molekulare Identifizierung der<em> Anopheles</em> Geschwister Spezies durch PCR.
Endemischen Ländern übernehmen zunehmend molekulare Werkzeuge für die effiziente Typisierung, Identifizierung und Überwachung gegen Malariaparasiten und Vektor Mücken, als integralen Bestandteil ihrer Bekämpfungsprogramme 1,2,3,4,5. Für eine nachhaltige Etablierung dieser genauen Ansätze in Operations Research zur Malaria-Kontrolle und Beseitigung Bemühungen, einfache und kostengünstige Methoden, mit sparsamen Reagenz und Anforderungen an die Ausrüstung zu stärken sind wesentliche 6,7,8. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Chelex-basierte Technik zur Gewinnung von Malaria-Parasiten und Vektor-DNA aus dem Feld gesammelt mosquito Proben.
Wir morphologisch identifizierten 72 Anopheles gambiae sl. Von 156 Moskitos durch Pyrethrum Spray fängt in den Schlafräumen der Haushalte innerhalb eines 2.000 km 2 Nähe des Malaria Institut Macha erfasst. Nach Dissektion, die Kopf und Thorax aus dem Bauch zu trennen für alle 72 Anopheles gambiae sl. Mücken, wurden die beiden Abschnitte einzeln in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen platziert und untergetaucht in 20 ul entionisiertem Wasser. Verwendung einer sterilen Pipettenspitze wurde jeder Abschnitt separat Mücken zu einer gleichmäßigen Suspension in entionisiertem Wasser homogenisiert. Der anschließenden Homogenat aus jeder Mücke Abschnitt wurde 10 ul beibehalten, während die anderen 10 ul einer separaten autoklavierten 1,5 ml Röhrchen überführt wurde. Die separaten Aliquots wurden DNA-Extraktion entweder durch die vereinfachte Chelex oder die Standard Aussalzen Extraktionsprotokoll 9,10 unterzogen. Das Protokoll ist Aussalzen sogenannte und weit verbreitet, weil sie hohe Salzkonzentrationen verwendet anstelle von gefährlichen organischen Lösungsmitteln (wie Phenol und Chloroform) für das Protein Fällungsschritt während der DNA-Extraktion 9.
Extrakte wurden als Matrizen für die PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern verwendet Targeting Arthropoden mitochondrialen Nicotinamidadenindinucleotid Dehydrogenasenase (NADH) Untereinheit 4-Gen (ND4) an DNA-Qualität 11, eine PCR zur Identifizierung von Anopheles gambiae Geschwisterart 10 und eine verschachtelte PCR zur Typisierung von Plasmodium falciparum-Infektion 12 zu überprüfen. Vergleich mit DNA-Qualität (ND4) PCR zeigten 93% Sensitivität und 82% Spezifität für die Chelex Ansatz gegenüber der etablierten Aussalzen Protokoll. Entsprechende Werte von Sensitivität und Spezifität waren 100% bzw. 78%, jeweils unter Verwendung Geschwisterart Identifizierung PCR und 92% und 80%, jeweils für P. falciparum Nachweis PCR. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Anteil an Proben, bei Amplikon Signals mit der oder den regulären Chelex Aussalzen Protokoll über alle drei PCR-Anwendungen. Die Chelex Ansatz erforderlich drei einfachen Reagenzien und 37 min in Anspruch, während das Aussalzen Protokoll brachte 10 verschiedene Reagenzien und 2 h und 47 min 'Bearbeitungszeit, einschließlich einer Übernachtung Schritt. Unsere Ergebnisse zeigen, tham Chelex Verfahren ist vergleichbar mit der vorhandenen Aussalzen Extraktion und kann als eine einfache und nachhaltige Ansatz mit beschränkten Ressourcen wo eine konstante Reagenz Lieferkette ist oft schwierig zu warten substituiert sein.
Die vereinfachte Chelex hier vorgestellte Methode ermöglicht die Extraktion der Qualität Anopheles spp und P. falciparum DNA aus Moskito-Proben zugänglich diverse PCR-Anwendungen. Diese Technik kann für die molekulare Identifizierung von Malariavektorkontrollschulung Mücken und Überwachung der Arzneimittel-resistente P. eingesetzt werden falciparum Allele in Mücken National Malaria Control Programs. Die Vorteile des vereinfachten Chelex Technik gehören Einfachheit, weniger Reagenzien und damit Kosten, Sicherheit und kürzere Bearbeitungszeiten (37 min) als Standard-Protokolle wie das Aussalzen Verfahren 10 (2 hr 47 min und einer Nacht Schritt, Tabelle 1). Die oben genannten Vorteile und minimale Reagenz Anforderungen (3 Reagenzien) auf den aktuellen Standard-Protokoll (10 Reagenzien, Tabelle 1) 11,15 gegenüber, machen die vereinfachte Chelex Protokoll besonders freundlich zu endemischen Land Laboratorien, in denen eine konstante ReagenzSupply Chain ist es oft schwierig zu pflegen. Eine Beschränkung des Verfahrens ist, dass wie die Standard-Protokoll, auch war Gegenstand PCR-Inhibitoren bekannt, in der Mücke Integument 16 auftreten. Jedoch ist dies ohne weiteres durch Einschluß von BSA in den Assays erleichtert. BSA wurde auch erfolgreich als Verstärkung Enhancer gegen Inhibitoren in anderen PCR-Anwendungen 17,18 beschäftigt.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken den Chefs, Häuptlinge und Gemeinden Macha für ihre unwaveing Zusammenarbeit während mosquito Feldprobe Sammlungen. Dr. Doug Norris und Rebekka Kent angeboten unschätzbares Fachwissen auf dem Aussalzen Protokoll. Diese Arbeit wurde von der Johns Hopkins Malaria Research Institute Pilot-Grant-System finanziert. Mosquito und Parasiten DNA-Labor Standards wurden freundlicherweise von MR4, American Type Culture Collection & gespendet.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
BSA | New England Biolabs | B9001S |