דרך מהירה ואפשרית כדי לחלץ טפיל מלריה ואיכות ה-DNA וקטור מדגימות יתושים מתוארת. ניצול תכונות chelating של שרף Chelex, השיטה הפשוטה מאפשרת genotyping של טפילי מלריה בשלבי יתושי בלוטת אמצע בטן ורוק, כמו גם זיהוי מולקולרי של<em> אנופלס</em> אח מינים באמצעות PCR.
מדינות אנדמיות יותר ויותר לאמץ כלים מולקולריים להקלדה יעילה, זיהוי ומעקב נגד טפילי מלריה ויתושי וקטור, כחלק בלתי נפרד מתוכניות בקרת 1,2,3,4,5. להקמת בר קיימא של גישות המדויקות אלה בפעולות מחקר כדי לחזק את שליטת מלריה ומאמצי חיסול, שיטות פשוטות ובמחיר סבירים, עם ריאגנט החסכן ודרישות ציוד חיוני 6,7,8. כאן אנו מציגים טכניקה Chelex מבוססת פשוטה לחילוץ טפיל מלריה ודנ"א מדגימות יתושי וקטור שדה שנאספו.
אנו מורפולוגית זיהו 72 אנופלס gambiae sl. מ156 יתושים שנתפסו על ידי Pyrethrum התרסיס תופס בחדרי שינה נפרדת של משקי בית תוך 2 קרבה 2,000 ק"מ של מכון המלריה בMacha. לאחר נתיחה כדי להפריד את הראש ובית החזה מהבטן לכל 72 אנופלס gambiae sl. יתושים, שני הסעיפים הונחו בנפרד ב1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל ושקוע ב20 μl מי deionized. באמצעות קצה פיפטה סטרילי, כל מקטע יתוש homogenized בנפרד להשעיה אחידה במי deionized. של homogenate שהתפתח מכל קטע יתוש, 10 μl נשמר תוך 10 μl האחר הועברה לצינור מ"ל נפרד autoclaved 1.5. את aliquots הנפרד נחשפו למיצוי DNA או על ידי Chelex הפשוט או סטנדרטי המלחה החוצה חילוץ פרוטוקול 9,10. פרוטוקול ההמלחה החוצה הוא מה שנקרא ושימוש נרחב משום שהיא מעסיקה ריכוז מלח גבוה במקום בממסים אורגניים מסוכנים (כגון פנול וכלורופורם) לצעד משקעי החלבון במהלך חילוץ דנ"א 9.
תמציות שמשו כתבניות להגברת PCR באמצעות פריימרים מיקוד dehydroge פרוקי הרגליים המיטוכונדריה ניקוטינמיד אדנין dinucleotidenase (NADH) 4 גן המקטע (ND4) כדי לבדוק את איכות דנ"א 11, PCR לזיהוי מיני אחי gambiae אנופלס 10 ו PCR מקונן להקלדה של זיהום Plasmodium falciparum 12. PCR השוואה באמצעות איכות ה-DNA (ND4) הראתה רגישות 93% וסגוליים 82% לגישה היחסית לפרוטוקול מבוסס המלחה החוצה Chelex. ערכים מקבילים של רגישות וסגולית היו 100% ו 78%, בהתאמה, באמצעות אח מיני זיהוי PCR ו92% ו 80%, בהתאמה, לפ falciparum האיתור PCR. לא היו הבדלים משמעותיים בשיעור של דגימות נותנות אות amplicon עם Chelex או המלחה מתוך פרוטוקול קבוע בכל השלושה יישומי PCR. גישת Chelex נדרשה שלושה ריאגנטים פשוטים ו37 דקות כדי להשלים, תוך המלחה מתוך הפרוטוקול הכרוך 10 ריאגנטים שונים ו2 זמן העיבוד "47 דקות hr ו, כולל צעד בן לילה. התוצאות שלנו מראות הבשיטת Chelex דומה לחילוץ הקיים המלחה החוצה וניתן להחליף כגישה פשוטה וברת קיימא בהגדרות משאבים מוגבלים שבי שרשרת אספקת מגיב קבועה היא לעתים קרובות קשה לתחזוקה.
השיטה הפשוטה Chelex מוצגת כאן מאפשרת מיצוי של האיכות אנופלס spp ופ דנ"א falciparum מדגימות המתאימים ליישומים מגוונים PCR יתושים. טכניקה זו יכולה להיות מועסקת לזיהוי מולקולרי של יתושי מלרית וקטור ומעקב של פ העמיד לתרופות אללים falciparum ביתושים לתוכניות בקרת מלריה לאומיות. יתרונותיה של הטכניקה הפשוטה Chelex כוללים פשטות, ריאגנטים פחות ולכן עלות, בטיחות וזמן עיבוד קצר יותר (37 דקות) מפרוטוקולים סטנדרטיים כגון (47 דקות 2 שעות וצעד לילה, טבלת 1) המלחה את השיטה 10. היתרונות הנ"ל והדרישות מינימאליות מגיבות (3 ריאגנטים) בהשוואה לפרוטוקול הסטנדרטי הנוכחי (10 ריאגנטים, טבלת 1) 11,15, להפיק את פרוטוקול Chelex הפשוט ידידותי במיוחד למעבדות במדינה אנדמית בי מגיבה מתמדתשרשרת אספקה היא לעתים קרובות קשה לתחזוקה. מגבלה של השיטה היא שכמו הפרוטוקול הסטנדרטי, זה היה גם נושא למעכבי PCR הידועים להתרחש בintegument יתושי 16. עם זאת, זו היא קלה בקלות על ידי הוספה של BSA במבחנים. BSA גם הועסק בהצלחה כהגברה משפרת נגד מעכבים ביישומי PCR אחרים 17,18.
The authors have nothing to disclose.
המחברים הם חבים לראשים, מוכתרים והקהילות של Macha לunwaveing לשתף הפעולה במהלך אוספים לדוגמא שדה יתושים. ד"ר דאג נוריס ורבקה קנט הציע מומחיות רבה ערך על פרוטוקול ההמלחה החוצה. עבודה זו מומנה על ידי מערכת ג'ונס הופקינס מלרית מכון מחקר פיילוט המענק. סטנדרטי הטפיל DNA מעבדת יתושים ונתרמו באדיבות על ידי MR4 סוג, אמריקאי ואוספת תרבות.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
BSA | New England Biolabs | B9001S |