En rask og rimelig måte å hente kvalitet malariaparasitten og vektor-DNA fra mygg prøver er beskrevet. Utnytte chelaterende egenskaper Chelex harpiks, muliggjør den enkle metoden genotyping av malariaparasitter i mygg midten gut og spyttkjertel faser samt molekylær identifisering av<em> Anopheles</em> Søsken arter av PCR.
Endemiske land blir stadig vedta molekylære verktøy for effektiv skriving, identifisering og overvåking mot malaria parasitter og vektor mygg, som en integrert del av deres kontrollprogrammer 1,2,3,4,5. For bærekraftig etablering av disse nøyaktige tilnærminger i drift forskning for å styrke malaria kontroll og eliminering innsats, enkle og rimelige metoder, med parsimonious reagens og utstyr krav er avgjørende 6,7,8. Her presenterer vi en enkel Chelex-basert teknikk for å trekke malariaparasitten og vektor-DNA fra feltet samlet mygg prøver.
Vi morfologisk identifiserte 72 Anopheles gambiae sl. Fra 156 mygg fanget av pyrethrum spray fanger i sove rom av husholdninger innenfor en 2000 km 2 nærhet av Malaria Institute ved Macha. Etter disseksjon å skille hodet og thorax fra magen for alle 72 Anopheles gambiae sl. mygg, ble de to seksjoner individuelt plassert i 1,5 ml mikrosentrifugerør og neddykket i 20 pl deionisert vann. Ved hjelp av en steril pipettespiss ble hver mygg seksjon separat homogenisert til en ensartet suspensjon i deionisert vann. Av den påfølgende homogenatet fra hver mygg seksjon ble 10 pl beholdes mens andre 10 ul ble overført til en separat autoklaverte 1,5 ml rør. De separate aliquoter ble underkastet DNA-ekstraksjon av enten forenklet Chelex eller standarden utsalting ekstraksjon protokoll 9,10. Den utsalting protokollen er såkalte og mye brukt fordi den benytter høye saltkonsentrasjoner i stedet for farlige organiske løsningsmidler (som for eksempel fenol-og kloroform) for proteinet utfellingstrinnet under DNA ekstraksjon 9.
Ekstrakter ble brukt som maler for PCR forsterkning ved hjelp av primere rettet arthropod mitokondrie nikotinamidadenindinukleotid dehydrogenase (NADH) subenheten 4 genet (ND4) for å sjekke DNA kvalitet 11, en PCR for identifisering av Anopheles gambiae søsken arter 10 og en nestet PCR for å skrive av Plasmodium falciparum infeksjon 12. Sammenligning med DNA kvalitet (ND4) PCR viste 93% sensitivitet og 82% spesifisitet for Chelex tilnærmingen forhold til den etablerte utsalting protokollen. Tilsvarende verdiene av sensitivitet og spesifisitet var 100% og 78%, henholdsvis, ved hjelp av søsken artsidentifikasjon PCR og 92% og 80%, henholdsvis for P. falciparum deteksjon PCR. Det var ingen signifikante forskjeller i andelen av prøver gir amplikon signal med Chelex eller vanlig utsalting protokoll tvers av alle tre PCR applikasjoner. Den Chelex tilnærming kreves tre enkle reagenser og 37 min for å fullføre, mens salting ut protokollen innebar 10 forskjellige reagenser og 2 t og 47 min 'saksbehandlingstid, inkludert en overnatting trinn. Våre resultater viser thpå Chelex metoden er sammenlignbar med den eksisterende utsalting ekstraksjon og kan være substituert som en enkel og bærekraftig tilnærming i ressurs-begrensede settinger hvor en konstant reagens forsyningskjede er ofte vanskelig å opprettholde.
Den forenklede Chelex metoden presentert her gjør utvinning av kvalitet Anopheles spp. og P. falciparum DNA fra mygg prøver mottagelig for ulike PCR-applikasjoner. Denne teknikken kan benyttes for molekylær identifisering av malaria vektor mygg og overvåking av multiresistent P. falciparum alleler i mygg for nasjonale malaria kontrollprogrammer. Fordelene med den forenklede Chelex teknikken inkluderer enkelhet, færre reagenser og dermed kostnader, sikkerhet og kortere behandlingstid (37 min) enn standard protokoller som utsalting metoden 10 (2 hr 47 min og en overnatting trinn, Tabell 1). De nevnte fordeler og minimale reagens krav (3 reagenser) i forhold til dagens standard protokoll (10 reagenser, Tabell 1) 11,15, få forenklet Chelex protokollen spesielt vennlig til endemiske land laboratorier hvor en konstant reagensforsyningskjede er ofte vanskelig å opprettholde. En begrensning av metoden er at som standard protokoll, var det også underlagt PCR-hemmere forekommer i myggen integument 16. Dette er imidlertid lett lindret av inkludering av BSA i analysene. BSA har også blitt ansatt som en forsterkning enhancer mot hemmere i andre PCR-programmer 17,18.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne står i gjeld til høvdinger, headmen og lokalsamfunn i Macha for deres unwaveing samarbeider under mygg feltet sample samlinger. Dr Doug Norris og Rebekka Kent tilbudt uvurderlig kompetanse på salting ut protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av Johns Hopkins Malaria Research Institute pilot stipendordninger. Mygg og parasitt DNA laboratorium standarder var vennlig donert av MR4, American Type & Culture Collection.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
BSA | New England Biolabs | B9001S |