En snabb och prisvärt sätt att extrahera parasiter kvalitet malaria och vektor-DNA från mygga prover beskrivs. Utnyttja kelatbildande egenskaper Chelex-harts, möjliggör den enkla metoden genotypning av malariaparasiter i mygga mitten gut och spottkörtel faser, liksom molekylär identifiering av<em> Anopheles</em> Syskon arter med PCR.
Endemiska länder i allt större utsträckning molekylära verktyg för effektiv typning, identifiering och övervakning mot malariaparasiter och myggor vektor, som en integrerad del av deras kontrollprogram 1,2,3,4,5. För en hållbar etablering av dessa exakta metoder i verksamheten forskning för att stärka malaria kontroll och insatser eliminering, enkla och prisvärda metoder, med snål reagens och utrustning är grundläggande 6,7,8. Här presenterar vi en enkel Chelex-baserad teknik för att extrahera malariaparasiten och vektor-DNA från fältet samlas mygga exemplar.
Vi identifierade morfologiskt 72 Anopheles gambiae sl. Från 156 myggor fångade av Pyrethrumextrakt spruta bifångster i sovrum hushåll inom en 2.000 km 2 närheten av Malaria Institute vid Macha. Efter dissekering för att separera huvudet och bröstkorgen från buken för alla 72 Anopheles GAMbiae sl. myggor, de två sektionerna placerades individuellt i 1,5 ml mikrorör och nedsänkt i 20 pl avjoniserat vatten. Med användning av en steril pipettspets, har varje sektion mygga separat homogeniserades till en enhetlig suspension i avjoniserat vatten. Av den efterföljande homogenatet från varje mygga sektion, var 10 pl kvar medan den andra 10 | il överfördes till en separat autoklaverad 1,5 ml rör. De separata alikvoter utsattes för DNA-extraktion från antingen den förenklade Chelex eller standarden utsaltning extraktion protokoll 9,10. Den utsaltning protokollet är så kallade och allmänt används eftersom det utnyttjar höga saltkoncentrationer i stället för farliga organiska lösningsmedel (såsom fenol och kloroform) för proteinutfällning steget under DNA-extraktion 9.
Extrakt användes som templat för PCR-amplifiering med användning av primrar riktade artropod mitokondrie nikotinamidadenindinukleotid dehydrogeNase (NADH) subenhet 4-genen (ND4) för att kontrollera DNA-kvalitet 11, en PCR för identifiering av Anopheles gambiae syskon arter 10 och en kapslad PCR för att skriva av Plasmodium falciparum-infektion 12. Jämförelse med hjälp av DNA kvalitet (ND4) PCR visade 93% sensitivitet och 82% specificitet för Chelex tillvägagångssättet i förhållande till den etablerade utsaltning protokoll. Motsvarande värden på känslighet och specificitet var 100% och 78%, respektive, med användning av syskon artidentifiering PCR och 92% och 80%, respektive för P. falciparum detektion PCR. Det fanns inga signifikanta skillnader i andelen prover som har gett amplicon signal med Chelex eller regelbunden utsaltning protokoll över alla tre PCR-program. Den Chelex metod som krävs tre enkla reagens och 37 min att slutföra, medan utsaltnings protokollet innebar 10 olika reagenser och 2 tim och 47 min "behandling tid, inklusive en övernattning steg. Våra resultat visar thpå Chelex metoden är jämförbar med den befintliga utsaltning extraktion och kan ersättas som en enkel och hållbar strategi i resursfattiga begränsad miljöer där en konstant reagens leveranskedjan är ofta svårt att upprätthålla.
Den förenklade Chelex metoden som presenteras här möjliggör extraktion av kvalitet Anopheles spp. och P. falciparum DNA från mygga prover lämpar sig för olika PCR-tillämpningar. Denna teknik kan användas för molekylär identifiering av myggor malaria vektor och övervakning av resistent P. falciparum alleler i myggor för nationella program malaria kontroll. Fördelarna med den förenklade Chelex tekniken inkluderar enkelhet, färre reagenser och därmed kostnad, säkerhet och kortare behandlingstid (37 min) än standardprotokoll såsom utsaltning metoden 10 (2 tim 47 min och en övernattning steg, tabell 1). De ovan nämnda fördelar och minimala krav reagens (3 reagenser) jämfört med den nuvarande standarden protokollet (10 reagens, tabell 1) 11,15, gör den förenklade Chelex protokollet särskilt vänliga för endemiska länder laboratorier där en konstant reagensleveranskedjan är ofta svårt att upprätthålla. En begränsning med metoden är att i likhet med standardprotokoll, var det också av PCR-hämmare är kända för att uppträda i mygga integument 16. Emellertid är detta lätt lindras genom införande av BSA i analyserna. BSA har också framgångsrikt använts som en förstärkning förstärkare mot inhibitorer i andra PCR program 17,18.
The authors have nothing to disclose.
Författarna står i tacksamhetsskuld till cheferna, hövdingar och gemenskaper av Macha för deras unwaveing samarbetar under mygga samlingar fältprov. Dr Doug Norris och Rebecka Kent erbjöd ovärderlig expertis på utsaltning protokollet. Detta arbete har finansierats av Johns Hopkins Malaria Forskningsinstitut pilot bidragssystem. Mygga och parasit-DNA laboratorium standarder vänligt donerats av MR4, American Type & Culture Collection.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
BSA | New England Biolabs | B9001S |