一种快速,经济实惠的方式来提取质量疟疾寄生虫的蚊子标本与载体DNA的方法。利用Chelex树脂螯合性能,简单的方法使基因分型疟疾寄生虫的蚊子中肠和唾液腺阶段,以及分子鉴定<em>按蚊</em近缘种PCR。
疾病流行的国家越来越多地采用高效的打字,识别和监视对疟疾寄生虫和媒介蚊虫的分子工具,作为一个组成部分,其控制方案1,2,3,4,5。可持续发展建立在操作这些准确的方法研究,以加强控制和消除疟疾的努力,简单又经济实惠的方法,吝啬的试剂和设备的要求是必不可少的6,7,8。在这里,我们提出了一个简单的Chelex从现场采集的蚊虫标本中提取疟疾寄生虫与载体DNA为基础的技术。
形态确定了72, 冈比亚按蚊SL。从156,由除虫菊喷雾捕获卧室的家庭在2,000 平方公里 ,附近的马查疟疾研究所在捕获的蚊子。经过解剖,分离的头部和胸部,腹部所有72个按蚊GAM两个部分BIAE sl的蚊子,单独放置在1.5毫升微量离心管中,并浸没在20微升的去离子水。使用无菌移液管尖,每个蚊子部分分别均匀的匀化的去离子水的悬浮液中。 10微升的随后从每个蚊子部匀浆中,被保留,而其他的10微升转移到一个单独的蒸压1.5 ml管。独立的等分试样进行DNA提取,不论是由简化的Chelex或标准盐析萃取协议9,10。盐析协议是所谓的和广泛使用的,因为它采用高盐浓度代替有害的有机溶剂(如苯酚和氯仿),用于DNA提取过程中的步骤9的蛋白质沉淀。
提取物被用作PCR扩增的模板,使用引物针对节肢动物线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶检查DNA的质量激酶(NADH)亚单位基因(ND4)11,PCR鉴定冈比亚按蚊亲缘种10和巢式PCR分型恶性疟原虫感染12。比较使用DNA质量(ND4),PCR结果显示93%的敏感性和特异性82%Chelex方法相对于既定的盐析协议。相应的值的敏感性和特异性分别为100%和78%,分别使用近缘种鉴定PCR和92%和80%,分别为P.恶性疟原虫检测PCR。有给扩增子的的Chelex或定期盐析协议在所有三个PCR应用与信号的样本比例无显着差异。 Chelex方法需要三个简单的试剂和37分钟完成,而盐析协议entailed 10个不同的试剂和2小时47分钟的处理时间,包括一晚一步。我们的研究结果表明Chelex法是与现有的盐析提取,并可以取代一个简单的和可持续的方法在资源有限的环境中恒定试剂的供应链往往是难以维持的。
简化Chelex这里介绍的方法,使提取质量按蚊属和P.恶性疟原虫的蚊子标本,适合不同的PCR应用DNA。这种技术可以用于传播疟疾的蚊子的分子鉴定和耐药监测P.恶性疟原虫基因蚊子为国家疟疾控制计划。简化Chelex技术的优点包括简单,试剂少,因此成本,安全性和较短的处理时间比标准协议,如盐析方法10(2小时47分钟,过夜的步骤, 表1)(37分钟)。上述优势和最小的试剂要求(试剂)相比,目前的标准协议(10个试剂, 表1),11,15,简化Chelex协议,特别是友好流行国家实验室,那里的恒定试剂供应链往往是难以维护。该方法的一个限制是一样的标准协议,它也发生在蚊虫珠被16 PCR抑制剂。然而,这是容易地解除通过包含在检测的BSA。 BSA也被成功地采用作为一个放大增强剂针对在其他PCR应用程序17,18的抑制剂。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢酋长,村长和马查为他们的unwaveing合作,在蚊子的现场样品采集的社区。道格·诺里斯博士和利百加肯特的盐析协议提供了宝贵的经验。这项工作是由约翰霍普金斯大学疟疾研究所试点补助金制度。蚊子和寄生虫DNA实验室标准MR4,美国的文化类型和收集捐赠。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
BSA | New England Biolabs | B9001S |