Summary
हम एक विधि वर्तमान में रहने की छल्ली कल्पना
Abstract
सी. की छल्ली एलिगेंस एक उच्च प्रतिरोधी संरचना है कि चारों ओर से घेरे के बाहरी पशु 1-4 है. छल्ली नहीं केवल पर्यावरण से पशु बचाता है, लेकिन यह भी शरीर के आकार निर्धारित करता है और 4-6 गतिशीलता में एक भूमिका निभाता है. कई परतों epidermal कोशिकाओं द्वारा secreted छल्ली शामिल एक बाह्यतम लिपिड परत 7 सहित,.
छल्ली में परिधीय लकीरें annuli की लंबाई पैटर्न जानवर कहा जाता है और 8 विकास के सभी चरणों के दौरान मौजूद हैं. Alae अनुदैर्ध्य लकीरें है कि विकास के विशिष्ट चरणों, L1, dauer, और वयस्क चरणों 2,9 सहित दौरान मौजूद हैं हैं . जीन में उत्परिवर्तन है कि चर्म संबंधी कोलेजन संगठन प्रभावित चर्म संबंधी संरचना और पशु शरीर आकारिकी 5,6,10,11 बदल सकते हैं . जबकि चर्म संबंधी डीआईसी प्रकाशिकी के साथ परिसर माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का उपयोग संभव है, मौजूदा तरीकों कि उजागर चर्म संबंधी संरचनाओं fluores शामिलप्रतिशत transgene 12 अभिव्यक्ति, एंटीबॉडी 13 धुंधला हो जाना, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 1. लेबल गेहूं रोगाणु agglutinin (WGA) भी चर्म संबंधी glycoproteins कल्पना है इस्तेमाल किया गया है, लेकिन महीन चर्म संबंधी 14 संरचनाओं को हल करने में सीमित है. चर्म संबंधी सतह धुंधला फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग देखा गया है, लेकिन 15 में विस्तार से कभी नहीं विशेषता. हम जीना सी. में छल्ली कल्पना विधि वर्तमान लाल फ्लोरोसेंट lipophilic डाई (1,1 'dioctadecyl-3, 3,3', perchlorate 3'tetramethylindocarbocyanine) DiI, जो आमतौर पर सी में प्रयोग किया जाता है का उपयोग एलिगेंस एलिगेंस पर्यावरण उजागर न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए. DiI धुंधला के लिए यह अनुकूलित प्रोटोकॉल annuli के उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट दृश्य alae, योनी, पुरुष पूंछ, और सी में द्विलिंग पूंछ स्पाइक के लिए एक सरल, मजबूत विधि है एलिगेंस.
Protocol
1. DiI की तैयारी का दाग
- 20 मिलीग्राम / एमएल DMF में DiI (Biotium, इंक, Hayward, CA) के एक शेयर के समाधान तैयार है. DiI प्रकाश संवेदी है, इसलिए प्रकाश से पन्नी में लपेटकर द्वारा DiI रक्षा.
- 399.4 μL M9 प्रत्येक आबादी के लिए 0.6 μL DiI शेयर जोड़कर DiI का काम कर रहे एक कमजोर पड़ने बनाएँ. यह काम कर रहे 30 μg / एमएल DiI में M9 के अंतिम कमजोर पड़ने देना चाहिए. यह एक साथ कई आबादी धुंधला के लिए किया जा पहुंचा सकते हैं. शील्ड DiI पन्नी में लपेटकर ट्यूब (ओं) द्वारा प्रकाश से.
2. नेमाटोड की तैयारी
- एक 60 मिमी पवित्र नेमाटोड की आबादी वाले प्लेट का प्रयोग करें. धीरे थाली की सतह भर में एक परिपत्र गति में तरल सभी लार्वा और वयस्क पशुओं को ढीला घूमता थाली से पशुओं M9 बफर में 0.5% ट्राइटन की एक समाधान X-100 का उपयोग कर धो लें. एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब में धो स्थानांतरण.
- तुरंत नीचे 30 सेकंड के लिए 2000 rpm पर जानवरों स्पिन. निकालें और त्यागने के रूप में समर्थन ज्यादाट्यूब के नीचे पशुओं के जन परेशान बिना संभव के रूप में ernatant.
- अवशिष्ट Triton एक्स 100, M9 बफर, स्पिन का उपयोग कम जानवरों कुल्ला, और सतह पर तैरनेवाला हटायें. इस कदम को एक बार दोहराएँ.
- समाधान में पशुओं resuspend ट्यूब और भंवर संक्षिप्त करने के लिए काम कर M9 में DiI समाधान के 400 μL जोड़ें.
- 20 में ट्यूब हिलाएँ ° सी क्षैतिज प्रकाश सुरक्षित वातावरण में 350 rpm पर 3 घंटे के लिए. अगर वांछित, जानवरों धुंधला के लिए 16 घंटे तक किया जा incubated कर सकते हैं.
- अनबाउंड डाई की राशि को कम करने के लिए, नीचे 20 सेकंड के लिए पशुओं स्पिन 2000 rpm पर. निकालें और पशुओं के जन परेशान बिना के रूप में बहुत संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- 400 μL M9 बफर में और बैक्टीरिया मुक्त एक एन जी एम अगर OP50 ई. के साथ वरीयता प्राप्त प्लेट के एक हिस्से पर तरल डालना Resuspend जानवरों कोलाई. पशुओं के लिए कम से कम 30 मिनट की वसूली की अनुमति दें. वसूली समय के दौरान पशुओं दूर DiI धुंधला तरल से और भोजन पर क्रॉल करना चाहिए. यह कदममुक्त DiI से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम कर देता है.
3. बढ़ते और नमूनों को देख
- पानी में 4% अगर पिगलो एक autoclave या एक माइक्रोवेव का उपयोग.
- पुन: प्रयोज्य spacers, जो अगर पैड के समान मोटाई सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है layering एक गिलास स्लाइड पर दो प्रयोगशाला टेप के टुकड़े से, बनाएँ. कुल दो स्पेसर स्लाइड्स.
- दो स्पेसर स्लाइड्स के बीच एक साफ गिलास स्लाइड व्यवस्थित. स्वच्छ गिलास स्लाइड के केंद्र पर पिघला हुआ अगर 4% की के बारे में 150 पिपेट μL (चार बूँदें). जल्दी पिघला हुआ एक अतिरिक्त स्लाइड का उपयोग करने के लिए एक अगर पैड के रूप में अगर कवर. ध्यान से कवर स्लाइड निकालने के लिए, पैड बढ़ते स्लाइड के शीर्ष पर केंद्रित रखने.
- विंदुक पैड पर निमेटोड संवेदनाहारी (100 सुक्ष्ममापी - 1 मिमी levamisole, उदाहरण के लिए) के 5 μL बारे.
- 8 पर्वत - संवेदनाहारी में 12 जानवरों और एक खुर्दबीन coverslip के साथ कवर.
- एक परिसर या confocal कम से कम एक 40x objecti के साथ लगे माइक्रोस्कोप का उपयोग पशुओं निरीक्षण किया है और / DSRed TRITC (या अन्य संगत) फिल्टर. DiI प्रतिदीप्ति उत्तेजना अधिकतम 549 एनएम है और इसके उत्सर्जन की अधिकतम बाध्य डाई (Biotium, Inc, Hayward, CA) के लिए 565 एनएम है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
DiI दाग सी. जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती की छल्ली एलिगेंस. चर्म संबंधी सतह annuli परिधीय furrows द्वारा अलग और कुछ चरणों में शामिल हैं, अनुदैर्ध्य लकीरें alae बुलाया. प्रत्येक विकास मंच के अलग 2 रचनाओं के साथ चर्म संबंधी संरचनाओं है. दोनों alae और annuli की लकीरें या furrows fluorescently दाग, सतह की संरचना पर निर्भर करता है, लार्वा और वयस्क चरणों के दौरान और इस पद्धति का उपयोग करके वसूली के एक दिन बाद दृश्यमान रहेगी. पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट speckles के कभी कभी (आंकड़े 2 एफ, जी) मनाया जाता है, लेकिन नियमित नहीं की (चित्रा 1, चित्रा 2A ई, एच, मैं). सभी छवियों कताई डिस्क confocal या, जब विख्यात, widefield (wf) यौगिक माइक्रोस्कोपी के साथ ले जाया गया.
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चित्रा 1. DiI छल्ली दाग और पर्यावरण उजागर न्यूरॉन्स. L2 चरण जानवर. 630x बढ़ाई. मोज़ेक छवि भागों ivision मैक सॉफ्टवेयर (BioVision टेक्नोलॉजीज, Exton, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया. छवियाँ Adobe Photoshop CS3 (एडोब सिस्टम्स, इंक, सैन जोस, CA) का उपयोग कर शामिल हो गए थे. स्केल बार = 10 सुक्ष्ममापी. DiI भी fluorescently दाग amphid और सिर और पूंछ में phasmid संवेदी न्यूरॉन्स क्रमशः (तीर कुछ निशान).
चित्रा 2. DiI fluorescently दाग सी. बाद भ्रूण के विकास के सभी चरणों में एलिगेंस छल्ली. 630x बढ़ाई. स्केल बार = 10 सुक्ष्ममापी. ए) L1 में जंगली प्रकार के पशुओं के धुंधला, बी) L2, सी dauer), डी) L3, ई) L4, और एफ) वयस्क चरणों. alae और कुंडलाकार लकीरें fluorescently L1 और dauer पशुओं में दाग (ए, सी). L2 पशुओं में DiI कुंडलाकार लकीरें दाग(बी). कुंडलाकार L3 और L4 जानवरों (डी, ई) में दाग furrows. alae के furrows और annuli वयस्क जानवरों (एफएच) में दाग हैं. Alae दो, पांच या तीन लकीरें (L1, dauer, या वयस्क जानवरों, क्रमशः में) है कि जानवर की लंबाई (तीर) 16 चलाने की रचना कर रहे हैं . Annuli जानवर आसपास परिधीय लकीरें (arrowheads, एफ, और जम्मू) बनाएँ. वयस्क उत्परिवर्ती पशुओं की छल्ली उदारवादी चर्म संबंधी संगठन दोष (GH) प्रदर्शित करते हैं. जी) alae की लकीरें असंतत (wf) कर रहे हैं. एच) अधिसंख्य alae लकीरें इनकार कर रहे हैं और branched या बंटवारा (wf). कोलेजन जीन म्यूटेंट alae और कुंडलाकार संगठन दोषों (IJ) दिखा रहे हैं. मैं) ट्रांसजेनिक जानवर में overexpressing pRF4 (rol-6 (su1006)) जानवर की लंबाई के लिए एक कोण पर, alae झूठ की लकीरें. जम्मू) ट्रांसजेनिक जानवरों overexpressing pRF4 (rol-6 (su1006)) में Annuli एक अनियमित पैटर्न प्रदर्शित करते हैं.
चित्रा 3. निर्वासनअल रूपात्मक संरचनाओं DiI धुंधला द्वारा प्रबुद्ध हैं 630x बढ़ाई. स्केल सलाखों = 10 सुक्ष्ममापी. DiI भी ए) वयस्क उभयलिंगी योनी, बी) वयस्क पुरुष पूंछ किरणों और प्रशंसक सहित अन्य बाहरी सुविधाओं पर प्रकाश डाला गया है, और सी) उभयलिंगी पूंछ स्पाइक (इस उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में काँटेदार).
चित्रा 4. छल्ली अब लगता है पर्यावरण उजागर न्यूरॉन्स की तुलना DiI के साथ दाग. 630x बढ़ाई. स्केल बार = 10 सुक्ष्ममापी. धुंधला के दो घंटे के बाद, amphid () नहीं दिखाया और phasmid संवेदी न्यूरॉन्स (तीर) पर्याप्त दाग रहे हैं. इसके विपरीत, छोटे जानवरों की छल्ली केवल आंशिक रूप से (नोक) पैच में दाग है.
| धोना | दाग समाधान (DiI +) | ऊष्मायन समय | छल्ली दाग |
| M9 + 0.5% Triton एक्स - 100 | M9 + 0.5% ट्राइटन X 100 | 2 बजे | नहीं |
| M9 + 0.5% ट्राइटन X 100 | M9 + 0.5% ट्राइटन X 100 | 3 घंटे | नहीं |
| M9 + 0.5% ट्राइटन X 100 | M9 | 2 बजे | आंशिक |
| M9 + 0.5% ट्राइटन X 100 | M9 | 3 घंटे | हां |
| M9 + 0.5% ट्राइटन X 100 | 2 0 एच | 2 बजे | आंशिक |
| M9 + 0.5% ट्राइटन X 100 | 2 0 एच | 3 घंटे | हां |
तालिका 1. अलग अलग परिस्थितियों के तहत चर्म संबंधी धुंधला विभिन्न ऊष्मायन समाधान और समय पशुओं में चर्म संबंधी धुंधला का अनुकूलन करने के लिए परीक्षण किया गया. एच 2 0, बाँझ आसुत जल. आंशिक धुंधला लार्वा छल्ली के बद धुंधला (चित्रा 4) इंगित करता है, हालांकि ग वयस्क छल्ली दागonsistently.
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Discussion
DiI धुंधला विधि यहाँ प्रस्तुत एक अपेक्षाकृत जल्दी और सुविधाजनक सी. एलिगेंस में छल्ली कल्पना के लिए अनुमति देता है. Repurposing और अनुकूलन एक सामान्य छवि पर्यावरण उजागर संवेदी न्यूरॉन्स 15,17 के लिए प्रयोग किया जाता विधि DiI fluorescently दोनों alae और कुंडलाकार संरचनाओं (आंकड़े 1 और 2) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से योनी, पुरुष पूंछ, उभयलिंगी और पूंछ स्पाइक दाग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 3). हमने पाया है कि ऊष्मायन समाधान और समय प्रभाव DiI की क्षमता लगातार छल्ली (तालिका 1, चित्रा 4) दाग. DiI धुंधला पर्यावरण उजागर न्यूरॉन्स के लिए विधि M9 में 100 एक्स Triton 15 के साथ एक ऊष्मायन दो घंटे के समय का उपयोग करता है . Surfactant के साथ एक M9 के प्रारंभिक धोने Triton एक्स 100 में मदद करता है चर्म संबंधी सतह से संदूषण हटायें है और clumping से पशुओं रोकता. हालांकि, एक ही बफर में एक धुंधला समाधान में पशुओं तीन घंटे incubating छल्ली (तालिका 1) धुंधला से डाई रोकता है.यह निमेटोड डिटर्जेंट समाधान में अब उपचार द्वारा बंद छीन किया जा रहा सतह पर lipids की वजह से हो सकता है. DiI छल्ली दाग के साथ पानी में पशुओं के ऊष्मायन, यह दर्शाता है कि M9 नमक छल्ली के DiI धुंधला समाधान के लिए की आवश्यकता नहीं है. हालांकि एक पानी आधारित प्रोटोकॉल neuronal DiI 15 धुंधला के लिए सिफारिश की है, हम पाते हैं कि पशुओं का इलाज इस तरह अक्सर अस्वस्थ दिखाई . जानवरों के 0.5% में संक्षेप धुलाई M9 में X-100 ट्राइटन, धुंधला समाधान में एक ऊष्मायन M9 के साथ तीन घंटे की बनाई गई द्वारा पीछा किया, चर्म संबंधी संरचनाओं के अनुरूप धुंधला प्रदान करता है और पशुओं की अच्छी तरह से किया जा रहा रखता है.
पशु अवलोकन के बाद बचाया जा सकता है है और बनाए रखा है, प्रत्यक्ष बहाव विश्लेषण की अनुमति है. इस पद्धति का एक सुविधाजनक उपकरण है कि कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया जा सकता है, सहित, लेकिन सीमित, चर्म संबंधी स्राव और संगठन, epidermal सेल विकास, heterochronic जीन रास्ते, और निमेटोड विकास के लिए नहीं है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम एस तनेजा - बागेश्वर, के.एच. Beifuss, एस Kedroske, और कोर्ट धन्यवाद. उपयोगी विचार - विमर्श के लिए Hsiao. इस काम आण्विक और सेलुलर चिकित्सा के TAMHSC विभाग से धन - अप शुरू द्वारा वित्त पोषित किया गया था. यौगिक गुंजाइश है और कताई डिस्क विभाग और डीन के TAMHSC कार्यालय द्वारा उपलब्ध कराए गए धन के साथ खरीदे थे. कुछ उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर, जो अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केन्द्र द्वारा वित्त पोषित है द्वारा प्रदान किया गया. pRF4 (rol-6 (su1006)) ए आग की एक उपहार था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF (Dimethylformamide) | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) | VWR international | EM-9410 | |
| M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4) | |||
| NGM (Nematode growth medium) | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Millipore | 1.01614 | 4% in water |
| Levamisole (Levamisole hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 31742 | 100 μM - 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR international | 16005-106 | |
| Microscope cover glasses | VWR international | 16004-302 | |
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
References
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