के विज़ुअलाइज़ेशन Caenorhabditis एलिगेंस छल्ली lipophilic महत्वपूर्ण डाई, DiI का प्रयोग संरचनाएं
Summary
हम एक विधि वर्तमान में रहने की छल्ली कल्पना<em> सी. एलिगेंस</em> लाल फ्लोरोसेंट lipophilic डाई (1,1 'dioctadecyl-3, 3,3', perchlorate 3'tetramethylindocarbocyanine) DiI, जो आमतौर पर में प्रयोग किया जाता है का उपयोग<em> सी. एलिगेंस</em> पर्यावरण उजागर न्यूरॉन्स को कल्पना करने के लिए. इस अनुकूलित प्रोटोकॉल के साथ, alae और कुंडलाकार चर्म संबंधी संरचनाओं DiI द्वारा दाग रहे हैं और यौगिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मनाया.
Abstract
सी. की छल्ली एलिगेंस एक उच्च प्रतिरोधी संरचना है कि चारों ओर से घेरे के बाहरी पशु 1-4 है. छल्ली नहीं केवल पर्यावरण से पशु बचाता है, लेकिन यह भी शरीर के आकार निर्धारित करता है और 4-6 गतिशीलता में एक भूमिका निभाता है. कई परतों epidermal कोशिकाओं द्वारा secreted छल्ली शामिल एक बाह्यतम लिपिड परत 7 सहित,.
छल्ली में परिधीय लकीरें annuli की लंबाई पैटर्न जानवर कहा जाता है और 8 विकास के सभी चरणों के दौरान मौजूद हैं. Alae अनुदैर्ध्य लकीरें है कि विकास के विशिष्ट चरणों, L1, dauer, और वयस्क चरणों 2,9 सहित दौरान मौजूद हैं हैं . जीन में उत्परिवर्तन है कि चर्म संबंधी कोलेजन संगठन प्रभावित चर्म संबंधी संरचना और पशु शरीर आकारिकी 5,6,10,11 बदल सकते हैं . जबकि चर्म संबंधी डीआईसी प्रकाशिकी के साथ परिसर माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का उपयोग संभव है, मौजूदा तरीकों कि उजागर चर्म संबंधी संरचनाओं fluores शामिलप्रतिशत transgene 12 अभिव्यक्ति, एंटीबॉडी 13 धुंधला हो जाना, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 1. लेबल गेहूं रोगाणु agglutinin (WGA) भी चर्म संबंधी glycoproteins कल्पना है इस्तेमाल किया गया है, लेकिन महीन चर्म संबंधी 14 संरचनाओं को हल करने में सीमित है. चर्म संबंधी सतह धुंधला फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग देखा गया है, लेकिन 15 में विस्तार से कभी नहीं विशेषता. हम जीना सी. में छल्ली कल्पना विधि वर्तमान लाल फ्लोरोसेंट lipophilic डाई (1,1 'dioctadecyl-3, 3,3', perchlorate 3'tetramethylindocarbocyanine) DiI, जो आमतौर पर सी में प्रयोग किया जाता है का उपयोग एलिगेंस एलिगेंस पर्यावरण उजागर न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए. DiI धुंधला के लिए यह अनुकूलित प्रोटोकॉल annuli के उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट दृश्य alae, योनी, पुरुष पूंछ, और सी में द्विलिंग पूंछ स्पाइक के लिए एक सरल, मजबूत विधि है एलिगेंस.
Protocol
Discussion
DiI धुंधला विधि यहाँ प्रस्तुत एक अपेक्षाकृत जल्दी और सुविधाजनक सी. एलिगेंस में छल्ली कल्पना के लिए अनुमति देता है. Repurposing और अनुकूलन एक सामान्य छवि पर्यावरण उजागर संवेदी न्यूरॉन्स 15,17 के लिए प्रयोग …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एस तनेजा – बागेश्वर, के.एच. Beifuss, एस Kedroske, और कोर्ट धन्यवाद. उपयोगी विचार – विमर्श के लिए Hsiao. इस काम आण्विक और सेलुलर चिकित्सा के TAMHSC विभाग से धन – अप शुरू द्वारा वित्त पोषित किया गया था. यौगिक गुंजाइश है और कताई डिस्क विभाग और डीन के TAMHSC कार्यालय द्वारा उपलब्ध कराए गए धन के साथ खरीदे थे. कुछ उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर, जो अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केन्द्र द्वारा वित्त पोषित है द्वारा प्रदान किया गया. pRF4 (rol-6 (su1006)) ए आग की एक उपहार था.
Materials
| Reagents | Synonyms | Company | Catalogue number | Comments |
| DiI | 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF | Dimethylformamide | Sigma-Aldrich, Inc. | D4551 | |
| Triton X-100 |
Octylphenoxypolyethoxyethanol | VWR International, LLC. | EM-9410 | |
| M9 | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4 | |||
| NGM | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Chemicals, Inc. | 1.01614 | 4% in water | |
| Levamisole | Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 31742 | 100 μM – 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR International, LLC. | 16005-106 | ||
| Microscope cover glasses | VWR International, LLC. | 16004-302 | ||
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment | |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET – DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
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