Summary
אנו מציגים שיטה לחזות לציפורן ב לחיות
Abstract
לציפורן של C. elegans הוא מבנה עמיד מאוד שמקיפה את החיצוני של 1-4 בעלי חיים. לציפורן לא רק מגן על בעלי החיים מהסביבה, אלא גם קובעת את צורת הגוף ואת תפקיד תנועתיות 4-6. כמה שכבות מופרש על ידי תאים אפידרמיס מהווים את לציפורן, כולל שכבת השומנים החיצונית 7.
רכסים ההיקפי לציפורן הנקרא דפוס annuli אורך החיה נוכחים במהלך כל שלבי ההתפתחות 8. Alae הם רכסי האורך שנמצאים בשלבים מסוימים של פיתוח, כולל L1, dauer, ובשלבים מבוגרים 2,9. מוטציות בגנים המשפיעים על הארגון קולגן cuticular יכול לשנות את מבנה הגוף החי cuticular מורפולוגיה 5,6,10,11. בעוד דימות באמצעות מיקרוסקופ cuticular מתחם עם אופטיקה DIC אפשרי, השיטות הקיימות המדגישות מבנים cuticular כוללים נורותאחוז transgene הביטוי 12, מכתים נוגדן 13, במיקרוסקופ אלקטרונים 1. תווית נבט חיטה agglutinin (WGA) שימש גם לדמיין גליקופרוטאינים cuticular, אבל היא מוגבלת בפתרון מבנים cuticular עדינה 14. הכתמה של פני השטח cuticular באמצעות צבע פלואורסצנטי נצפתה, אך מעולם לא מתאפיין בפירוט 15. אנו מציגים שיטה לחזות לציפורן של חיים ג elegans באמצעות ניאון אדום lipophilic לצבוע DiI (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3 ", 3'-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט), אשר נמצא בשימוש נפוץ ב C. elegans לדמיין עצב חשוף לסביבה. זה פרוטוקול אופטימיזציה עבור מכתים DiI היא שיטה פשוטה, חזקים להדמיה ברזולוציה גבוהה הניאון של annuli, alae, הפות, זנב זכר, אנדרוגינוס זנב ספייק ב C. elegans.
Protocol
1. הכנת DiI כתם
- הכן פתרון מלאי של DiI 20 מ"ג / מ"ל (Biotium, Inc, הייוורד, קליפורניה) ב DMF. DiI אור רגישים, כל כך להגן DiI מן האור על ידי לפפה בנייר כסף.
- צור דילול העבודה של DiI ידי הוספת 0.6 μL מניות DiI ל 399.4 M9 μL לכל אוכלוסיית. זה אמור לתת דילול עובד הסופי של 30 מיקרוגרם / מ"ל DiI ב M9. זה יכול להיות scaled עד מכתים עבור אוכלוסיות מרובות בו זמנית. מגן DiI מן האור על ידי עטיפת הצינור (ים) בנייר.
2. הכנת נמטודות
- השתמש צלחת 60 מ"מ המכיל אוכלוסיית נמטודות מזוהמת. לשטוף חיות מהצלחת באמצעות פתרון של 0.5% טריטון X-100 במאגר M9 ידי בעדינות מתערבל נוזל בתנועה מעגלית על פני הצלחת לשחרר את כל החיות הזחל ואת הבוגר. העברת לשטוף לתוך צינור סטרילי 1.5 מ"ל.
- מיד ספין למטה החיות בסל"ד 2000 למשך 30 שניות. הסר וזורקים כמה supernatant ככל האפשר מבלי להפריע המונית של בעלי חיים בתחתית של התחתית.
- כדי להפחית את טריטון שיורית X-100, יש לשטוף באמצעות בעלי חיים M9 חיץ, ספין, ולהסיר supernatant. חזור על פעולה זו פעם אחת.
- הוספת 400 μL של פתרון DiI עובד M9 אל הצינור בקצרה מערבולת כדי resuspend חיות הפתרון.
- Shake צינור ב 20 מעלות אופקית במשך 3 שעות ב 350 סל"ד בסביבה אור המוגן. אם תרצה, בעלי חיים יכול להיות מודגרות עד 16 שעות מכתים.
- כדי להפחית את כמות צבע מאוגד, ספין למטה החיות בסל"ד 2000 למשך 20 שניות. הסר וזורקים כמו supernatant האפשר מבלי להפריע המונית של בעלי חיים.
- בעלי חיים Resuspend במאגר 400 M9 μL ויוצקים נוזלי על חלק חיידק חינם של צלחת אגר NGM seeded עם OP50 E. coli. אפשר חיות להתאושש לפחות 30 דקות. בזמן התאוששות החיות צריך לזחול ולהתרחק הנוזל מכתים DiI ואל המזון. שלב זהמפחית את הקרינה הרקע DiI חינם.
3. הרכבה והתבוננות דגימות
- ממיסים אגר 4% במים באמצעות החיטוי או מיקרוגל.
- צור מפרידי לשימוש חוזר, אשר ניתן להשתמש בהם על מנת להבטיח עובי אחיד של כרית אגר, על ידי שכבות שתי חתיכות של נייר במעבדה על זכוכית שקופית. בצע שתי שקופיות spacer מוחלט.
- סדר שקופיות זכוכית נקייה בין שתי שקופיות spacer. פיפטה כ - 150 μL (ארבע טיפות) של אגר 4% מותכת על המרכז של השקופית זכוכית נקייה. במהירות לכסות את אגר מותכת באמצעות שקופית נוספת כדי ליצור משטח אגר. בזהירות להסיר את השקופית לכסות, לשמור על כרית במרכז החלק העליון של השקופית גובר.
- פיפטה על μL 5 של נמטודות הרדמה (100 מיקרומטר - 1 levamisole מ"מ, למשל) על גבי משטח.
- הר 8-12 חיות ההרדמה ומכסים coverslip מיקרוסקופ.
- שימו לב בעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ המתחם או confocal מצויד objecti לפחות 40X יש ו DSRed / TRITC (או אחרים תואם) לסנן. מרבית הקרינה של עירור DiI הוא 549 ננומטר שלה היא פליטה מרבי 565 ננומטר עבור צבע כבול (Biotium, Inc, הייוורד, קליפורניה).
4. נציג תוצאות
כתמים DiI את הקוטיקולה של ג wild-type ו מוטנטים elegans. המשטח מכיל cuticular annuli מופרדים על ידי תלמים היקפיים ו, בשלבים מסוימים, רכסי האורך נקרא alae. כל שלב התפתחותי יש מבנים cuticular עם קומפוזיציות שונות 2. רכסי או תלמי alae והן annuli fluorescently כתם, תלוי בהרכב פני השטח, לאורך כל שלבי הזחל לבין הבוגר נשארות גלויות עד יום אחד לאחר התאוששות באמצעות שיטה זו. Speckles רקע פלורסנט הם נצפו לעתים (איורים 2F, G), אך לא שגרתי (איור 1, איור 2A-E, H, I). כל התמונות צולמו עם דיסק confocal ספינינג או, כאשר ציין, widefield (WF) מיקרוסקופיה המתחם.
אף אוזן גרון ">
באיור 1. כתמים DiI לציפורן ונוירונים חשופים לסביבה. L2 חיה הבמה. 630x ההגדלה. תמונה חלקי פסיפס נתפסו באמצעות iVision-Mac תוכנה (BioVision טכנולוגיות, Exton, הרשות הפלסטינית). תמונות הצטרפו באמצעות Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, Inc, בסן חוזה, קליפורניה). בר סולם = 10 מיקרומטר. DiI גם fluorescently כתמים amphid ואת עצב סנסורי phasmid בראש הזנב בהתאמה (חיצים לסמן כמה).
באיור 2. DiI fluorescently כתמים ג elegans לציפורן בכל שלבי הפיתוח שלאחר עובריים. 630x ההגדלה. בר סולם = 10 מיקרומטר. הכתמה של wild-type בעלי חיים) L1; B) L2; C) dauer: D) L3; E) L4, ו-F) בשלבים הבוגרים. רכסים alae ו טבעתי מוכתמות fluorescently בחיות L1 ו dauer (A, C). כתמים DiI רכסים טבעתי בחיות L2(B). טבעתי תלמים כתם L3 ו L4 בעלי חיים (D, E). תלמי alae ו annuli מוכתמות בבעלי חיים מבוגרים (FH). Alae מורכבים שנתיים, חמש או שלוש רכסים (ב L1, dauer, או בבעלי חיים מבוגרים, בהתאמה) כי בטווח של אורך החיה (חיצים) 16. Annuli ליצור רכסים ההיקפי סביב החיה (ראשי חץ, F ו-J). לציפורן של חיות מוטנטים מבוגר להציג מתונה פגמים ארגון cuticular (GH). G) רכסי alae הם רציפה (WF). H) רכסים alae העודפים הם התמזגו קנים או מפוצלת (WF). מוטנטים קולגן גן תערוכה alae פגמים ארגון טבעתי (IJ). אני) אצל בעלי חיים מהונדס overexpressing pRF4 (רול-6 (su1006)), רכסים של שקר alae בזווית לאורך של החיה. J) Annuli ב מהונדס חיות overexpressing pRF4 (רול-6 (su1006)) להציג דוגמה חריגה.
באיור 3. תלמיד חצונימבנים מורפולוגיים אל מוארים על ידי מכתים DiI. בהגדלה 630x. ברים סולם = 10 מיקרומטר. DiI גם מדגיש תכונות חיצוניות אחרות, כולל א ') בוגר אנדרוגינוס הפות, ב) זכר בוגר קרני הזנב מעריץ, ו-C) אנדרוגינוס זנב ספייק (מפוצל ברקע הזה מוטציה).
לציפורן איור 4. לוקח יותר זמן עם כתם DiI מאשר נוירונים חשופים לסביבה. 630x ההגדלה. בר סולם = 10 מיקרומטר. אחרי שעתיים של מכתים, amphid (לא מוצג) ו - עצב סנסורי phasmid (חיצים) מוכתמות דיו. לעומת זאת, לציפורן של בעלי חיים צעירים היא רק חלקית מוכתם בכתמים (ראש חץ).
| לשטוף | פתרון כתמים (+ DiI) | זמן דגירה | לציפורן מוכתם |
| M9 + 0.5% Trעיתון X-100 | M9 + 0.5% טריטון X-100 | 2 שעות | לא |
| M9 + 0.5% טריטון X-100 | M9 + 0.5% טריטון X-100 | 3 שעות | לא |
| M9 + 0.5% טריטון X-100 | M9 | 2 שעות | חלקי |
| M9 + 0.5% טריטון X-100 | M9 | 3 שעות | כן |
| M9 + 0.5% טריטון X-100 | H 2 0 | 2 שעות | חלקי |
| M9 + 0.5% טריטון X-100 | H 2 0 | 3 שעות | כן |
טבלה 1. מכתים Cuticular בתנאים שונים. הדגירה פתרונות שונים פעמים נבדקו כדי לייעל מכתים cuticular בבעלי חיים. H 2 0, מים מזוקקים סטריליים. צביעה חלקית מציין מכתים אחידה של לציפורן הזחל (איור 4), אם כי כתמי לציפורן מבוגר גonsistently.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה מכתים DiI המוצג כאן מאפשר דרך מהירה ונוחה יחסית לדמיין את הקוטיקולה של C. elegans. לפי repurposing וייעול שיטת נפוץ נוירונים תמונה חשופה לסביבה החושית 15,17, DiI ניתן להשתמש fluorescently כתם הן alae ומבנים טבעתי (איורים 1 ו -2), כמו גם את הפות, זנב זכר, אנדרוגינוס זנב ספייק (איור 3). מצאנו כי הפתרון הדגירה והשפעה זמן את היכולת של DiI באופן עקבי הכתם לציפורן (טבלה 1, איור 4). השיטה נוירונים DiI חשוף לסביבה מכתים משתמשת זמן של שעתיים הדגירה ב M9 עם טריטון X-100 15. לשטוף הראשונית של M9 עם פעילי שטח טריטון X-100 מסייע להסיר הזיהום מפני השטח cuticular ומונע את החיות מן clumping. עם זאת, דוגרים החיות שלוש שעות בתמיסה מכתים במאגר לצבוע אותו מונע מן מכתים את הקוטיקולה (טבלה 1).זה עשוי להיגרם על ידי שומנים על פני השטח נמטודות להיות פשט על ידי הטיפול כבר בפתרון חומר ניקוי. דגירה של בעלי חיים במים עם כתמים DiI את הקוטיקולה, המציין את תמיסת מלח M9 לא נדרש מכתים DiI של לציפורן. אף על פי פרוטוקול מבוסס מים מומלצת מכתים DiI העצבית 15, אנו מוצאים כי בעלי החיים שטופלו בדרך זו לעתים קרובות להופיע בריא. כביסה בעלי חיים בקצרה 0.5% טריטון X-100 ב M9, ואחריו הדגירה שלוש שעות בתמיסה מכתים עשה עם M9, מספק מכתים עקבית של מבנים cuticular ושומר על רווחתם של בעלי החיים.
בעלי חיים יכולים להינצל לאחר תצפית ומתוחזק, המתיר מנתח הזרם הישיר. שיטה זו היא כלי נוח שיכול לשמש במחקרים רבים, כולל, אך לא רק הפרשה, cuticular וארגון, פיתוח תא אפידרמיס, מסלולים heterochronic גן, ואת האבולוציה נמטודות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו שום דבר לגלות.
Acknowledgments
אנו מבקשים להודות ש-Taneja Bageshwar, ק Beifuss, ש Kedroske, ו HC. סיאו לדיונים מועילים. עבודה זו מומנה על ידי סטארט אפ קרנות מהמחלקה TAMHSC לרפואה מולקולרית תאית. היקף המתחם דיסק ספינינג נרכשו במימון המחלקה לבין משרד TAMHSC של הדיקן. זנים מסוימים סופקו על ידי גנטיקה Caenorhabditis מרכז, אשר ממומנת על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר. pRF4 (רול-6 (su1006)) הייתה מתנה האש א.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF (Dimethylformamide) | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) | VWR international | EM-9410 | |
| M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4) | |||
| NGM (Nematode growth medium) | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Millipore | 1.01614 | 4% in water |
| Levamisole (Levamisole hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 31742 | 100 μM - 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR international | 16005-106 | |
| Microscope cover glasses | VWR international | 16004-302 | |
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
References
- Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
- Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development. Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).
- Hall, D., Altun, Z. C. elegans Atlas. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. The C. elegans Research Community. , WormBook. (2007).
- Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55, 555-565 (1988).
- Mende, N. von, Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape. Cell. 55, 567-576 (1988).
- Blaxter, M. L. Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).
- Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle. Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).
- Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).
- Johnstone, I. L. Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans. Trends Genet. 16, 21-27 (2000).
- Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen. Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).
- Thein, M. C. Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology. Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).
- McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).
- Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans. Development. 103, 485-495 (1988).
- Tong, Y. G., Burglin, T. R. Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).
- Singh, R. N., Sulston, J. E. Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans. Nematologica. 24, 63-71 (1978).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148, 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
