我们提出了一个可视化生活角质层的方法<em> C。线虫</em>使用红色荧光亲脂性染料DII(1,1' – 双十八烷基- 3,3,3',3' – tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐),这是常用的<em> C。线虫</em>可视化环境接触的神经元。这种优化的协议,alae和环形表皮结构是由DII染色和使用复合显微镜观察。
角质层的C.线虫是一种高度耐药的结构,周围的动物 1-4外部。角质层不仅可以保护环境的动物,但也决定体形和蠕动4-6次的作用。由表皮细胞分泌的几层组成的角质层,包括最外层的脂质层7。
在角质层的圆周脊称为环空中的模式动物的长度, 目前在8发展的所有阶段。 Alae有纵脊目前是在特定的发展阶段,包括L1的dauer,和成人阶段2,9。影响表皮胶原组织的基因突变可以改变表皮结构和动物的身体形态 5,6,10,11 。虽然使用DIC的光学显微镜复合表皮成像是可行的,目前的方法,突出表皮结构包括荧光12%的转基因表达,抗体染色,电子显微镜1。也被用来标记麦胚凝集素(WGA)的可视化表皮糖蛋白,但受限于解决更精细的表皮结构 14 。使用荧光染料染色表皮表面已被观察到,但从来没有在细节 15的特点。我们提出了一个方法来可视化角质层在现场 C. 线虫使用红色荧光亲脂性染料DII(1,1' -双十八烷基- 3,3,3',3' – tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐),也就是通常用于在 C 线虫可视化环境接触的神经元。这是一个简单可靠的方法,高分辨率的荧光可视化的环空中,alae,外阴,男性的尾巴, 在 C和雌雄同体的尾穗DII染色的优化协议线虫 。
这里介绍DII的染色方法,允许一个相对快速和方便的方法来可视化的角质层线虫。再利用和优化常用的图像环境暴露15,17感觉神经元的方法,直接投资收益可用于荧光染色alae和环状结构(图1和2),以及外阴,男性的尾巴,和雌雄同体的尾穗(图3)。我们发现,洗液和时间的影响的直接投资收益的能力,始终染色的角质层(表1,图4)。 DII染色环境暴露的神经元的方法使用两个小?…
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢S.塔内加- Bageshwar,K. Beifuss,S. Kedroske,和HC。萧为有益的讨论。这项工作是由从分子和细胞医学TAMHSC系的启动资金。该化合物的范围和旋转盘购部门和TAMHSC院长办公室提供的资金。一些菌株提供了线虫遗传学中心,这是由国家研究资源中心资助。 pRF4(ROL – 6(su1006))答:消防的礼物。
Reagents | Synonyms | Company | Catalogue number | Comments |
DiI | 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
DMF | Dimethylformamide | Sigma-Aldrich, Inc. | D4551 | |
Triton X-100 |
Octylphenoxypolyethoxyethanol | VWR International, LLC. | EM-9410 | |
M9 | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4 | |||
NGM | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
Agar-agar | EMD Chemicals, Inc. | 1.01614 | 4% in water | |
Levamisole | Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 31742 | 100 μM – 1 mM levamisole as required |
Microscope slides | VWR International, LLC. | 16005-106 | ||
Microscope cover glasses | VWR International, LLC. | 16004-302 | ||
Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment | |
TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET – DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |