Summary
Vi presenterar en metod för att visualisera nagelband i levande
Abstract
Nagelbanden av C. elegans är en mycket motståndskraftig struktur som omger utsidan av djuret 1-4. Nagelbanden inte bara skyddar djur från miljön, men också avgör kroppsform och spelar en roll i motilitet 4-6. Flera lager utsöndras av epidermal celler består av nagelband, inklusive en yttersta lipid skikt 7.
Perifera åsar i nagelbanden kallas annuli mönster längden på djuret och är närvarande vid alla stadier av utveckling 8. Alae är längsgående åsar som finns under vissa stadier av utveckling, inklusive L1, Dauer, och scener vuxna 2,9. Mutationer i gener som påverkar cuticular kollagen organisation kan förändra cuticular struktur och djurkroppen morfologi 5,6,10,11. Medan cuticular avbildning med hjälp av sammansatta mikroskopi med DIC optik är möjligt, nuvarande metoder som framhäver cuticular strukturer omfattar lysrörprocent transgens uttryck 12, antikroppar färgning 13, och elektronmikroskopi 1. Märkta vetegroddar agglutinin (WGA) har också använts för att visualisera cuticular glykoproteiner, men är begränsad till att lösa finare cuticular strukturer 14. Färgning av cuticular yta med hjälp av fluorescerande färg har observerats, men aldrig karakteriseras i detalj 15. Vi presenterar en metod för att visualisera nagelband i levande C. elegans med röda fluorescerande lipofila färg DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat), som ofta används i C. elegans att visualisera miljömässigt utsatta nervceller. Detta optimerat protokoll för DII färgning är en enkel, robust metod för högupplösta fluorescerande visualisering av annuli, alae, vulva, manliga svans, och hermafroditer svans spik i C. elegans.
Protocol
1. Beredning av DII fläcken
- Bered en stamlösning på 20 mg / ml DII (Biotium, Inc., Hayward, CA) i DMF. DII är ljuskänsligt, så skydda DII från ljus genom att linda i folie.
- Skapa en fungerande utspädning av DII genom att tillsätta 0,6 mikroliter DII lager till 399,4 mikroliter M9 för varje befolkning. Detta bör ge en slutlig arbetar utspädning av 30 mikrogram / ml DII i M9. Detta kan skalas upp för färgning flera populationer samtidigt. Shield DII från ljus genom att linda röret (er) i folie.
2. Beredning av nematoder
- Använd en 60 mm plåt med en befolkning på okontaminerad nematoder. Tvätta djur från plattan med en lösning av 0,5% Triton X-100 i M9 buffert genom att försiktigt snurra vätskan i en cirkulär rörelse över ytan av plattan för att lossa alla larver och vuxna djur. Överför tvätta i en steril 1,5 ml rör.
- Omedelbart spinn ner djuren vid 2000 rpm i 30 sek. Ta bort och kasta så mycket stödernatant som möjligt utan att störa massa djur på botten av röret.
- För att minska kvarvarande Triton X-100, spola djur med M9 buffert, snurra och ta bort supernatanten. Upprepa detta steg en gång.
- Tillsätt 400 mikroliter av att arbeta DII lösning i M9 till röret och vortexa kortfattat resuspendera djur i lösningen.
- Skaka röret vid 20 ° C horisontellt i 3 timmar vid 350 rpm i en ljus-skyddad miljö. Om så önskas kan djuren inkuberas upp till 16 timmar för missfärgning.
- För att minska mängden obundet färgämne, spinn ner djuren vid 2000 rpm för 20 sek. Avlägsna och kassera så mycket supernatanten som möjligt utan att störa massa djur.
- Resuspendera djur i 400 mikroliter M9 buffert och häll vätskan på en bakteriefri del av ett NGM agarplatta ympats med OP50 E. coli. Låt djuren för att täcka åtminstone 30 minuter. Under återhämtningstiden djuren ska krypa bort från DII färgning vätska och på maten. Detta stegminskar bakgrundsfluorescens från gratis DII.
3. Montering och observera prover
- Smält 4% agar i vatten med en autoklav eller mikrovågsugn.
- Skapa återanvändbara distanser, som kan användas för att säkerställa en enhetlig tjocklek agar pad, genom att skikta två bitar av lab tejp på en glasskiva. Gör två spacer diabilder totalt.
- Ordna en ren glasskiva mellan två spacer diabilder. Pipettera cirka 150 mikroliter (fyra droppar) av smält 4% agar på mitten av rent glas bilden. Snabbt täcka smält agar med en extra bild för att bilda en agar pad. Ta försiktigt bort locket bilden, hålla pad centrerad på toppen av montering bilden.
- Pipettera ca 5 mikroliter av nematoder bedövning (100 mikroM - 1 mm levamisol, till exempel) på plattan.
- Mount 8 till 12 djur i narkos och täck med ett mikroskop täckglas.
- Observera djur med hjälp av en förening eller konfokalmikroskop utrustade med minst en 40x SYFTE ve och en DSRed / TRITC (eller andra kompatibla) filter. Fluorescens excitation högst DII är 549 nm och dess utsläpp maximum är 565 nm för bundna färgämne (Biotium, Inc., Hayward, CA).
4. Representativa resultat
DII fläckar nagelbanden av vildtyp och mutant C. elegans. Den cuticular yta innehåller annuli separerade med omkretsriktningen fåror och, i vissa scener, som kallas längsgående åsar alae. Varje utvecklingsstadium har cuticular strukturer med olika kompositioner 2. Åsar eller fåror i både alae och annuli fläcken fluorescerande, beroende på ytans sammansättning, hela larver och vuxna stadier och förbli synliga upp till en dag efter återvinning med denna metod. Bakgrund fluorescerande fläckar ibland observeras (figur 2F, G), men inte rutinmässigt (Figur 1, Figur 2A-E, H, I). Alla bilder togs med snurrande skiva konfokala eller, när noteras widefield (WF) förening mikroskopi.
ENT ">
Figur 1. DII fläckar nagelband och miljömässigt utsatta nervceller. L2 skede djur. 630x förstoring. Mosaic image delar fångades med iVision-Mac-program (BioVision Technologies, Exton, PA). Bilder anslöt med hjälp av Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA). Skala = 10 mikrometer. DII också fluorescerande fläckar amphid och fasmid sensoriska neuroner i huvudet och svansen respektive (pilar markerar vissa).
Figur 2. DII fluorescerande fläckar C. elegans nagelbanden på alla stadier av post-embryots utveckling. 630x förstoring. Skala = 10 mikrometer. Färgning av vildtyp djur i A), L1, B) L2, C) Dauer, D) L3, e) L4, och f) vuxna stadier. Den alae och ringformiga åsar är fluorescerande färgade i L1 och Dauer djur (A, C). DII fläckar ringformig åsar i L2 djur(B). Ringformig fåror fläcken i L3 och L4 djur (D, E). Fårorna i alae och annuli färgas hos vuxna djur (FH). Alae består av två, fem, eller tre åsar (i L1, Dauer, eller djur vuxna, respektive) som körs längden av djur (pilarna) 16. Annuli skapa perifera åsar runt djuret (pilspetsar, F och J). Nagelbanden av vuxna muterade djur visar måttlig cuticular organisation defekter (GH). G) Ridges av alae är diskontinuerliga (WF). H) Övertaliga alae åsar är smält och grenade och tvåspetsnitar (WF). Kollagen gen mutanter uppvisar alae och ringformiga defekter organisation (IJ). I) I transgena djur överuttryck pRF4 (ROL-6 (su1006)), åsar av alae ligger i vinkel mot längden på djuret. J) Annuli i transgena djur överuttryckande pRF4 (ROL-6 (su1006)) visas ett oregelbundet mönster.
Figur 3. ExternAl morfologiska strukturer är upplyst av DII färgning. 630x förstoring. Skala staplar = 10 mikrometer. DII belyser också andra yttre funktioner, inklusive A) vuxna hermafroditer vulva, B) vuxna manliga svans strålar och fläkt, och C) hermafroditer svans spik (kluven i denna mutant bakgrunden).
Figur 4. Cuticle tar längre tid att fläcken med DII än miljömässigt utsatta nervceller. 630x förstoring. Skala = 10 mikrometer. Efter två timmar av färgning är amphid (visas ej) och fasmid sensoriska neuron (pilar) är tillräckligt färgade. Däremot är fjällskiktet på yngre djur endast delvis färgade fläckvis (pilspets).
| Tvätta | Bets-lösning (+ DII) | Inkubationstid | Cuticle betsad |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 + 0,5% Triton X-100 | 2 timmar | inga |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 + 0,5% Triton X-100 | 3 timmar | inga |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 | 2 timmar | partiell |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 | 3 timmar | ja |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | H 2 0 | 2 timmar | partiell |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | H 2 0 | 3 timmar | ja |
Tabell 1. Cuticular färgning under olika förhållanden. Olika inkubation lösningar och tider har testats för att optimera cuticular färgning hos djur. H 2 0, sterilt destillerat vatten. Partiell färgning indikerar fläckvis färgning av larver nagelband (Figur 4), men vuxna nagelband fläckar Consistently.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den DII färgningsmetod presenteras här ger en relativt snabbt och bekvämt sätt att visualisera nagelbanden i C. elegans. Genom att återanvända och optimera en metod som ofta används för att bilden miljömässigt utsatta sensoriska neuroner 15,17, kan DII användas till fluorescerande färg både alae och ringformiga strukturer (figur 1 och 2) samt vulva, manliga svans, och hermafroditer svans spik (Figur 3). Vi har funnit att inkubationstiden lösningen och tid påverka förmågan av DII konsekvent att färga nagelband (Tabell 1, Figur 4). Metoden för DII färgning miljömässigt utsatta neuroner använder en två timmars inkubationstid på M9 med Triton X-100 15. En första tvätt av M9 med tensiden Triton X-100 hjälper till att avlägsna föroreningar från cuticular ytan och hindrar djur från klumpar. Men inkubering av djuren tre timmar i en färgning lösning i samma buffert hindrar färgen från färgning av nagelband (tabell 1).Detta kan orsakas av lipider på nematoden ytan som klädde av den längre behandling i rengöringsmedel. Inkubering av djur i vatten med DII fläckar nagelbanden, vilket indikerar att M9 saltlösning inte krävs för DII färgning av nagelband. Även ett vatten-baserat protokoll rekommenderas för neuronala DII färgning 15, finner vi att djur behandlas på detta sätt ofta verkar ohälsosamt. Tvätt djur kort i 0,5% Triton X-100 i M9, följt av en tre timmars inkubation i färglösningen gjorda med M9, ger jämn infärgning av cuticular strukturer och upprätthåller välfärd för djuren.
Djur kan räddas efter observation och underhållas, vilket möjliggör direkt nedströms analyser. Denna metod är ett praktiskt verktyg som kan användas i många studier, inklusive, men inte begränsat till, cuticular sekretion och organisation, epidermal cell utveckling, heterochronic vägar gen, och nematoder evolution.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske, och HC. Hsiao för bra diskussioner. Detta arbete har finansierats av start-up medel från TAMHSC Institutionen för molekylär och cellulär medicin. Substansen omfattning och spinning disk har köpts med medel från institutionen och TAMHSC kontoret för Dean. Vissa stammar lämnades av Caenorhabditis Genetics Center, som finansieras av National Center for Research Resources. pRF4 (rol-6 (su1006)) var en gåva av A. Fire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF (Dimethylformamide) | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) | VWR international | EM-9410 | |
| M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4) | |||
| NGM (Nematode growth medium) | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Millipore | 1.01614 | 4% in water |
| Levamisole (Levamisole hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 31742 | 100 μM - 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR international | 16005-106 | |
| Microscope cover glasses | VWR international | 16004-302 | |
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
References
- Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
- Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development. Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).
- Hall, D., Altun, Z. C. elegans Atlas. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. The C. elegans Research Community. , WormBook. (2007).
- Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55, 555-565 (1988).
- Mende, N. von, Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape. Cell. 55, 567-576 (1988).
- Blaxter, M. L. Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).
- Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle. Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).
- Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).
- Johnstone, I. L. Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans. Trends Genet. 16, 21-27 (2000).
- Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen. Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).
- Thein, M. C. Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology. Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).
- McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).
- Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans. Development. 103, 485-495 (1988).
- Tong, Y. G., Burglin, T. R. Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).
- Singh, R. N., Sulston, J. E. Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans. Nematologica. 24, 63-71 (1978).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148, 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
