Summary
Vi presenterer en metode for å visualisere cuticle i live
Abstract
Cuticle av C. elegans er en svært motstandsdyktig struktur som omgir utsiden av dyret 1-4. Cuticle ikke bare beskytter dyret fra omgivelsene, men også bestemmer kroppsform og spiller en rolle i motilitet 4-6. Flere lag utskilt av epidermale celler omfatter skjellaget, inkludert en ytterst lipid lag 7.
Omkrets rygger i skjellaget kalt annuli mønster lengden på dyret, og er til stede under alle utviklingsstadier 8. Alae er langsgående rygger som er til stede under spesifikke utviklingsstadier, inkludert L1, dauer, og voksne stadier 2,9. Mutasjoner i gener som påvirker cuticular kollagen organisasjon kan endre cuticular struktur og dyr kroppsplanen 5,6,10,11. Mens cuticular bildebehandling bruker sammensatte mikroskopi med DIC optikk er mulig, dagens metoder som synliggjør cuticular strukturer inkluderer fluoressent transgenet uttrykk 12, antistoff flekker 13, og elektron en mikroskopi. Merket hvetespirer agglutinin (WGA) har også blitt brukt til å visualisere cuticular glykoproteiner, men er begrenset i løse finere cuticular strukturer 14. Farging av cuticular overflaten ved hjelp av fluoriserende fargestoff har blitt observert, men aldri karakterisert i detalj 15. Vi presenterer en metode for å visualisere cuticle i live C. elegans med røde fluorescerende lipofile fargestoff DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat), som ofte brukes i C. elegans å visualisere miljømessig utsatt nerveceller. Dette optimalisert protokoll for DII farging er en enkel, robust metode for høy oppløsning fluorescerende visualisering av annuli, alae, vulva, male hale, og hermafroditt hale pigg i C. elegans.
Protocol
1. Utarbeidelse av DII flekken
- Forbered en stamløsning på 20 mg / ml DII (Biotium, Inc., Hayward, CA) i DMF. DII er lys sensitive, så beskytt DII fra lys ved å pakke inn i folie.
- Lag en arbeidsgruppe utvanning av DII ved å tilsette 0,6 mL DII lager til 399,4 mL M9 for hver populasjon. Dette bør gi en endelig jobbe fortynning på 30 mikrogram / ml DII i M9. Dette kan skaleres opp til farging flere populasjoner samtidig. Shield DII fra lys ved å pakke røret (e) i folie.
2. Utarbeidelse av nematoder
- Bruk en 60 mm plate som inneholder en befolkning på forurenset nematoder. Vask dyr fra platen ved hjelp av en løsning av 0,5% Triton X-100 i M9 buffer ved forsiktig virvlende væske i sirkelbevegelser over overflaten av platen for å løsne alle larver og voksne dyr. Overfør vask i en steril 1,5 ml tube.
- Umiddelbart spin ned dyrene ved 2000 rpm i 30 sek. Fjern og kast så mye støtteernatant som mulig uten å forstyrre den massen av dyr på bunnen av røret.
- For å redusere residual Triton X-100, skyll dyr bruker M9 buffer, spinn, og fjern supernatanten. Gjenta dette trinnet en gang.
- Legg til 400 mL arbeide DII løsning i M9 til røret og vortex kort til resuspender dyr i løsningen.
- Rist tube ved 20 ° C horisontalt for 3 timer ved 350 rpm i en lys-beskyttet miljø. Hvis ønskelig, kan dyr være inkubert opptil 16 timer for farging.
- For å redusere mengden av ubundet fargestoff, spinne ned dyrene ved 2000 rpm i 20 sek. Fjern og kast så mye supernatant som mulig uten å forstyrre massen av dyr.
- Resuspender dyr i 400 mL M9 buffer og hell væsken på en bakterie-fri del av en NGM agar plate seeded med OP50 E. coli. La dyr å utvinne minst 30 minutter. Under restitusjonstid dyrene skal krype unna DII flekker væske og på maten. Dette trinnetreduserer bakgrunnsfluorescens fra gratis DII.
3. Montering og observere prøver
- Smelt 4% agar i vann ved hjelp av en autoklav eller en mikrobølgeovn.
- Lage gjenbrukbare avstandsstykker, som kan brukes til å sikre ensartet tykkelse på agar pad, med lagdeling to stykker av lab tape på et glass slide. Lag to spacer lysbilder totalt.
- Arranger et rent glass-slide mellom to spacer lysbilder. Pipetter ca 150 mL (fire dråper) av smeltet 4% agar på midten av rent glass slide. Raskt dekke smeltet agar med et ekstra skyv for å danne en agar pad. Fjern forsiktig dekselet lysbilde, holder puten sentrert på toppen av montering lysbildet.
- Pipetter ca 5 mL av nematode bedøvelse (100 mM - 1 mM levamisole, for eksempel) på pad.
- Mount 8-12 dyr i narkose og dekk med et mikroskop dekkglass.
- Observer dyrene ved hjelp av en sammensatt eller confocal mikroskop utstyrt med minst en 40x objecti ve og en DSRed / TRITC (eller andre kompatible) filter. Fluorescens eksitasjon maksimalt DII er 549 nm og dens utslipp maksimum er 565 nm for bundet fargestoff (Biotium, Inc., Hayward, CA).
Fire. Representant Resultater
DII flekker cuticle av villtype og mutant C. elegans. Den cuticular Overflaten inneholder annuli atskilt av omkrets furer, og i noen stadier, kalt langsgående rygger alae. Hver utviklingsstadiet har cuticular strukturer med tydelige komposisjoner 2. Rygger eller furer av både alae og annuli fluorescensmerket beis, avhengig av overflaten sammensetning, gjennom larve og voksen stadier og være synlig opp til en dag etter at gjenoppretting ved hjelp av denne metoden. Bakgrunn fluorescerende flekker er ofte observert (Tall 2F, G), men ikke rutinemessig (Figur 1, Figur 2A-E, H, I). Alle bildene ble tatt med spinning disk confocal eller når bemerket, widefield (WF) compound mikroskopi.
ent ">
Figur 1. DII flekker cuticle og miljømessig utsatt nerveceller. L2 scenen dyr. 630x forstørrelse. Mosaic image deler ble tatt med iVision-Mac-programvare (BioVision Technologies, Exton, PA). Bildene ble sluttet å bruke Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA). Scale bar = 10 mikrometer. DII også fluorescensmerket flekker amphid og phasmid sensoriske nevroner i hodet og halen henholdsvis (pilene merket noen).
Figur 2. DII fluorescensmerket flekker C. elegans cuticle på alle stadier av post-embryonale utvikling. 630x forstørrelse. Scale bar = 10 mikrometer. Farging av vill-type dyr i A) L1; B) L2; C) dauer; D) L3; E) L4, og F) voksne stadier. Den alae og ringformede rygger er fluorescensmerket beiset i L1 og dauer dyr (A, C). DII flekker ringformet høydedrag i L2 dyr(B). Ringformet furer flekken i L3 og L4 dyr (D, E). Den furer av alae og annuli er beiset i voksne dyr (FH). Alae er sammensatt av to, fem eller tre rygger (i L1, dauer eller voksne dyr, henholdsvis) som kjører lengden på dyret (piler) 16. Annuli skape omkrets rygger rundt dyret (pilspisser, F og J). Cuticle av voksne muterte dyr vise moderate cuticular organisasjon defekter (GH). G) Ridges av alae er usammenhengende (WF). H) overtallige alae rygger er smeltet og forgrenet og splittnagler (WF). Kollagen genet mutanter utstilling alae og ringformet organisasjon defekter (IJ). I) I transgene dyr overekspresjon pRF4 (rol-6 (su1006)), rygger av alae ligge på skrå til lengden på dyret. J) Annuli i transgene dyr overekspresjon pRF4 (rol-6 (su1006)) vise et uregelmessig mønster.
Figur 3. Eksternal morfologiske strukturer er opplyst av DII farging. 630x forstørrelse. Scale barer = 10 mikrometer. DII fremhever også andre ytre funksjoner, inkludert A) voksen hermafroditt vulva, B) voksne mannlige tail stråler og fan, og C) hermafroditt hale spike (delte seg i denne mutant bakgrunnen).
Figur 4. Cuticle tar lengre tid å farge med DII enn miljømessig utsatt nerveceller. 630x forstørrelse. Scale bar = 10 mikrometer. Etter to timer med flekker, er amphid (ikke avbildet) og phasmid sensoriske nevroner (piler) nok flekkete. I motsetning er cuticle av yngre dyr kun delvis beiset i patcher (pilspiss).
| Vask | Stain løsning (+ DII) | Inkubasjonstid | Cuticle stained |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 + 0,5% Triton X-100 | 2 timer | no |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 + 0,5% Triton X-100 | 3 timer | no |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 | 2 timer | delvis |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 | 3 timer | ja |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | H 2 0 | 2 timer | delvis |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | H 2 0 | 3 timer | ja |
Tabell 1. Cuticular flekker under ulike forhold. Forskjellige inkubasjonstid løsninger og tider ble testet for å optimalisere cuticular flekker hos dyr. H 2 0, sterilt destillert vann. Delvis flekker indikerer flekkvis farging av larve cuticle (figur 4), men voksen cuticle flekker consistently.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den DII flekker Metoden som presenteres her gir en relativt rask og praktisk måte å visualisere skjellaget i C. elegans. Ved repurposing og optimalisering av en metode som ofte brukes til å image miljømessig utsatt sensoriske nevroner 15,17, kan DII brukes til fluorescensmerket flekker både alae og ringformede strukturer (Figur 1 og 2), samt vulva, male hale, og hermafroditt hale spike (figur 3). Vi har funnet ut at inkubasjonstiden løsningen og tid påvirke evnen til DII å konsekvent stain cuticle (tabell 1, figur 4). Metoden for DII beising miljømessig utsatt nevroner bruker en to-timers inkubasjonstid i M9 med Triton X-100 15. En innledende vask av M9 med surfactant Triton X-100 bidrar til å fjerne forurensning fra cuticular overflaten og hindrer dyrene fra clumping. Men incubating dyrene tre timer i en flekker løsning i samme buffer hindrer fargestoff fra flekker cuticle (Tabell 1).Dette kan være forårsaket av lipider på nematode overflaten blir strippet av ved lengre behandling i syntetisk vaskemiddel. Inkubasjon av dyr i vann med DII flekker skjellaget, indikerer at M9 salt løsning ikke er nødvendig for DII farging av cuticle. Selv om en vann-basert protokoll anbefales for neuronal DII beising 15, finner vi at dyr behandlet på denne måten ofte vises usunn. Vaske dyr kort i 0,5% Triton X-100 i M9, etterfulgt av en tre-timers inkubering i farging løsning laget med M9, gir konsekvent farging av cuticular strukturer og opprettholder trivsel for dyrene.
Dyr kan være reddet etter observasjon og vedlikeholdt, tillater direkte nedstrøms analyser. Denne metoden er et praktisk verktøy som kan brukes i mange studier, inkludert men ikke begrenset til, cuticular sekresjon og organisasjon, epidermal celle utvikling, heterochronic genet pathways, og nematode evolusjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske, og HC. Hsiao for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble finansiert av oppstarten midler fra TAMHSC Department of Molecular and Cellular Medicine. Den sammensatte omfang og spinning disk ble kjøpt med midler gitt av avdelingen og TAMHSC kontor Dean. Noen stammer var gitt av Caenorhabditis Genetics Center, som er finansiert av National Center for Research Resources. pRF4 (rol-6 (su1006)) var en gave A. Fire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF (Dimethylformamide) | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) | VWR international | EM-9410 | |
| M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4) | |||
| NGM (Nematode growth medium) | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Millipore | 1.01614 | 4% in water |
| Levamisole (Levamisole hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 31742 | 100 μM - 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR international | 16005-106 | |
| Microscope cover glasses | VWR international | 16004-302 | |
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
References
- Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
- Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development. Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).
- Hall, D., Altun, Z. C. elegans Atlas. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. The C. elegans Research Community. , WormBook. (2007).
- Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55, 555-565 (1988).
- Mende, N. von, Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape. Cell. 55, 567-576 (1988).
- Blaxter, M. L. Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).
- Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle. Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).
- Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).
- Johnstone, I. L. Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans. Trends Genet. 16, 21-27 (2000).
- Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen. Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).
- Thein, M. C. Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology. Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).
- McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).
- Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans. Development. 103, 485-495 (1988).
- Tong, Y. G., Burglin, T. R. Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).
- Singh, R. N., Sulston, J. E. Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans. Nematologica. 24, 63-71 (1978).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148, 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
