אנו מדגימים כיצד לנתח ותרבות חומוס הגנגליון E4 statoacoustic ו E6 explants חוט השדרה. Explants הם תרבותי תחת בסרום ללא תנאים ג'ל קולגן 3D עבור 24 שעות. ההיענות Neurite נבדק עם המדיום גורם הגדילה, שיושלם עם חלבון מצופים חרוזים.
איברי חושים של האוזן הפנימית עוף מעוצבבים על ידי תהליכים של הפריפריה הגנגליון (SAG) נוירונים statoacoustic. עצבוב איבר חושי תלוי בשילוב רמזים של האקסון הדרכה 1 וגורמים הישרדות 2 הממוקמים לאורך מסלול של האקסונים לגדול ו / או מטרות בתוך החושית שלהם איברים. לדוגמה, הפרעה תפקודית עם מסלול הדרכה קלאסי האקסון איתות, semaphorin-neuropilin, שנוצר misrouting של אקסונים otic 3. כמו כן, גורמי גדילה אחדים לידי ביטוי את יעדי חושית של האוזן הפנימית, לרבות Neurotrophin-3 (NT-3) ו neurotrophic נגזר המוח פקטור (BDNF), הופעלו חיות טרנסגניות, שוב מובילה misrouting של אקסונים SAG 4. אלו מולקולות לקדם אותו בשתי הישרדות neurite תולדה של נוירונים SAG חומוס במבחנה 5,6.
כאן, אנו לתאר ולהדגים את שיטת במבחנה אנחנו כרגע uלשיר על מנת לבחון את ההיענות של neurites חומוס SAG חלבונים מסיסים, כולל morphogens ידוע כגון Wnts, כמו גם גורמי גדילה חשובים לקידום neurite SAG תולדה והישרדות נוירון. באמצעות מערכת זו המודל, אנו מקווים להסיק מסקנות לגבי ההשפעות כי ligands המופרש יכול להפעיל על ההישרדות SAG נוירון ו תולדה neurite.
Explants SAG הם גזור ביום עובריים 4 (E4) תרבותי תלת ממדי ג'ל סרום קולגן תחת ללא תנאי למשך 24 שעות. ראשית, ההיענות neurite הוא נבדק על ידי explants culturing עם בינוני בתוספת חלבון. לאחר מכן, כדי לשאול אם מקורות נקודת ligands מופרש יכולה להיות השפעה על כיווני תולדה neurite, explants הם שיתוף תרבותי עם חלבון מצופים חרוזים assayed על היכולת של חרוז כדי לקדם או לעכב מקומית תוצאה. אנו כוללים גם הפגנה של דיסקציה (שינה פרוטוקול 7) והתרבות של E6 explants חוט השדרה. אנומשתמשים באופן שגרתי explants חוט השדרה על מנת לאשר bioactivity של חלבונים חלבון ספוג חרוזים, ולוודא מינים תגובתיות צולבת עם רקמה חומוס, בתנאים תרבות כמו explants SAG. אלה מבחני חוץ גופית הם נוח במהירות ההקרנה של מולקולות מפעילים trophic (הישרדות) או טרופי (כיווני) ההשפעות על נוירונים SAG, במיוחד לפני ביצוע מחקרי in vivo. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת בדיקה של מולקולות בודדות תחת בסרום ללא תנאים, עם הישרדות נוירון גבוהה 8.
אנו מציגים שיטה לנתח ותרבות SAG E4 ו E6 explants חוט השדרה, מן חומוס, תחת בסרום ללא תנאים. הליך זה משמש כיום במעבדה שלנו כדי לחקור את ההשפעות של ligands שונים המופרשים על ההישרדות SAG נוירון ו תולדה neurite. היבטים רומן של פרוטוקול זה כולל את השימוש במערכת בסרום חופשי עבור explants culturing וש?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט RO1DC002756 ואת המחקר Purdue קרן. אנו מודים דוריס וו צ'אנג ויזה לייעוץ עם ניסויים רודני McPhail לעזרה עם דמויות.
Reagent | Company | Catalogue number | Comment |
Equipment |
|
||
Dissection microscope |
|
We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | |
Slide warmer | C.S. & E. |
Collagen polymerization | |
Chicken egg incubator |
|
||
37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator |
|
||
|
|||
Dissection Materials |
|
||
Sylgard© coated petri dish |
|
||
24-well cell culture plate | Corning |
3526 | |
#5 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11252-30 | |
#55 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11295-51 | |
Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools |
26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
Moria perforated spoon | Fine Science Tools |
10370-17 | Embryo harvest/transfer |
200 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
118-96R | Explant transfer |
|
|||
E4 and E6 chicken eggs |
|
||
Chick Ringer’s solution |
|
Embryo harvest | |
HBSS | Sigma |
H8264 | SAG dissection |
L15 medium | Sigma |
L5520 | Spinal cord dissection medium |
Fetal calf serum | Atlanta Biologicals |
S11150 | Spinal cord dissection medium |
Vannas Scissors | World Precision Instruments |
501778 | Spinal cord dissection |
|
|||
Collagen preparation |
|
||
Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences |
354249 | Explant culture |
10X PBS (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
1N NaOH (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
Distilled water (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman |
2629-990 | To check collagen pH |
15 ml conical tubes | Dot Scientific Inc |
818-PG | |
500 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
119-R100 | To pipet collagen |
|
|||
Explant culture |
|
||
DMEM/F12 medium | Sigma |
D8437 | Explant culture medium |
ITS+1 | Sigma |
I2521 | Medium supplement |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen |
15140-122 | Medium supplement |
CNTF (rat) | Sigma |
C3835 | Medium supplement |
NT-3 (human) | Sigma |
N1905 | Medium supplement |
Purified mouse Wnt5a | R&D Systems |
645-WN-010 | |
Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad |
153-7302 | |
|
|||
Immunohistochemistry |
|
||
Paraformaldehyde | Sigma |
P6148 | Fixation |
PBS |
|
Rinses | |
Triton X-100 | Sigma |
T9284 | Blocking solution |
Sodium azide | Sigma |
S8032 | Blocking solution |
Calf serum | Invitrogen |
16170-078 | Blocking solution |
Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma |
T8535 | Labels cell bodies and neurites |
Alexa fluor 488 goat anti –mouse IgG2b antibody | Invitrogen |
A21141 | Detects β Tubulin antibody |
Teflon micro spatula | VWR |
57949-033 | Release collagen gels from well |