DNA損傷の検出のための半人工分子機械とその使用のin vitroでの組立に

Summary

我々は、トポイソメラーゼのタンパク質を搭載した分子スケールデバイスのアセンブリとアプリケーションを示しています。構造は、その両端に二つの異なる蛍光色素を付加することにより組織切片におけるDNA切断の2つの主要なタイプを標識する生体分子センサーです。

Abstract

天然由来のバイオ分子のマシンはすべての生きている細胞では機能とデザインを^1-6の様々な表示。まだ方向運動、すなわち分子モーターの対応デバイス上で、そしてそのスケールダウンした機械部品（ホイール、アクスル、ペンダント等^）7-9人工分子機械の中心の開発。これは、慣性と運動量の保存など、これらのデバイスに不可欠な物理特性は、ナノワールドの環境で¹⁰に使用できないにもかかわらず、マクロマシンを模したもの。機械的なmacromachinesスキームに従い、生体分子の進化に開発した機構を使用しない代替デザインは、、ナノワールドの特定の条件を活用することができます。に加えて、ナノ設計の目的のために実際の生体分子を適応させるナノテクノロジー製品がもたらす可能性のある潜在的な危険を減らすことができます。ここでは、そのようなバイオ対応構造のアセンブリとアプリケーションを示すように人工的な成分で、天然に存在する分子機械を組み合わせたEMI -人工分子デバイス。ビューの酵素学の観点から、私たちの構造は、デザイナーの蛍光酵素基質複合体の特定の有用な機能を実行するために一緒に入れています。それは1つの^12が含まれ^ているとして、このアセンブリは、定義により分子機械です。まだ、エンジニアリング部との統合-蛍光二重ヘアピン- DNA損傷^12を標識する新しいタスクにそれを再指示する。

私たちの構造は32量体DNAと酵素ワクトポイソメラーゼI（VACC TOPO）から組み立てます。マシンは、2つの蛍光標識検出器ユニット（図1）を製造するために、独自の材料を使用しています。ユニットの一つ（緑色蛍光）が運ぶ共有結合その3'末端と別のユニット（赤色蛍光）に接続されているVACC TOPOは、ターミナル3'OH無料ヘアピンです。ユニットは短命で、すぐにその後recleavesオリジナルの構造に戻し、組み立て直す。DNAの非存在下で周期的に継続的に独立したとreligateこれら二つのユニットを壊します。 DNA損傷による組織切片では、トポイソメラーゼを運ぶ検出器ユニットは、選択的に蛍光ラベルを付けます、5'OHと平滑末端DNAの切断（DNase処理II型改^）11,12に接続します。オリゴヌクレオチド開裂の後に形成された第二、酵素のないヘアピンT4 DNAリガーゼは、ソリューション^13,14内に存在する場合、5'PO ₄平滑末端ブレーク（DNアーゼI -型改^）11,12、にライゲートされます。 T4 DNAリガーゼは、組織切片または5'PO ₄平滑末端切断したDNAを含む溶液に添加されると、リガーゼは、準安定酵素- DNA複合体を形成し、5'PO ₄ DNAの末端と反応する。平滑末端ヘアピンは、このように5'PO ₄平滑末端DNAの切断をラベリング、DNAにリガーゼと共有結合リンクのヘアピンをリリースするこれらの複合体と相互に作用します。

この開発は、番目に新しい実用的なアプローチを例示している電子の分子機械の設計とは、固定された細胞や組織におけるアポトーシスとDNA損傷の検出に有用なセンサーを提供します。

Protocol

それらの調製方法は、分子デバイスの組立よりも時間がかかるため、分子機械ベースの検出のためのセクションは、最初に準備する必要があります。構造はパラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋組織ブロックから切り出した5量6μm厚のセクションでうまく動作します。このようなProbeOnプラスに帯電しprecleanedスライド（フィッシャーサイエンティフィック）または同様の同様のセクショ…

Discussion

このビデオでは、我々は、デュアルラベリングDNA損傷のセンサーを組み立て、使用する方法を示します。センサーは、生体分子のエンジン、人工的なコンポーネントにリンクされているウイルスでエンコードされたタンパク質VACCのTOPOによって駆動分子機械です。提示の開発は、非毒性の分子スケールデバイス^12,15の設計に生物学的構造、アーキテクチャとセルの実際の部品とコンポ?…

Materials

1. Xylene
2. 80 and 96% Ethanol.
3. 2% solution of bovine serum albumin (BSA) in distilled water.
4. Oligonucleotide 1: a double-hairpin, dual labeled with fluorescein and tetramethylrhodamine:

5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT RAT GCG TT- 3′; F – FITC-dT; R – Tetramethylrhodamine-dT. Other red-shifted fluorophores such as BODIPY TR, rhodamine or TAMRA can be used instead of tetramethylrhodamine as R.

Alternatively you can use Oligonucleotide 2 – a double-hairpin single labeled with fluorescein (for detection of a single type of DNA breaks (DNase II-type only). The single-fluorophore-carrying probe is considerably less expensive and is convenient whenever a single type of DNA break is to be labeled: 5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3′; F – FITC-dT

5. Oligonucleotide 3. Blunt-ended rhodamine-labeled hairpin for enhancement of in situ ligation signal with T4 DNA ligase: 5′-GCG CTA GAC CRG GTC TAG CGC-3′; R – Tetramethylrhodamine-dT
6. Vaccinia DNA topoisomerase l (VACC TOPO) – 3000 U/μL (Vivid Technologies). In the initial experiments we used 215 pmoles (7.1 μg) of the VACC TOPO per every 25 μL of the reaction mix. However, the topoisomerase concentration can be significantly reduced without the loss of sensitivity. We later used a four times lesser amount of VACC TOPO per section (1.76 μg in 25 μL of the reaction mix per section) with similar results. Reducing amount of the enzyme to 880 ng (in 25 μL of the reaction mix) resulted in a weaker signal and 8.8 ng of VACC TOPO produced no detectable signal.
7. T4 DNA ligase 5 U/μL (Roche). This highly concentrated ligase preparation gives the best signal in our experimental conditions.
8. 10 x reaction buffer for T4 DNA ligase: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl₂, 10 mM dithioerythritol, 10 mM ATP, pH 7.5 (20° C) (Roche) . ATP in reaction buffer is easily destroyed in repetitive cycles of thawing-freezing. Aliquot the buffer in small 15-20 μL portions and store at – 20° C. Use once.
9. 30% (w/v) solution of PEG-8000 (Sigma) in bidistilled water. 15 % PEG-8000 in the reaction mix strongly stimulates the detection, increasing the effective concentrations of its constituents by volume exclusion.
10. Proteinase K (Roche) 20 mg/mL stock solution in distilled water. Store at – 20° C. In the reaction use 50mg/mL solution in PBS, prepared from the stock. Do not reuse.
11. Vectashield with DAPI (Vector Laboratories).
12. Sodium bicarbonate buffer: 50mM NaHCO₃, 15mM NaCl, pH 8.2.
13. 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section.