Summary
Мы демонстрируем сборки и применения молекулярного масштаба устройство питается от топоизомеразы белка. Конструкция био-молекулярных датчиков, какие метки два основных типа разрывов ДНК в срезах тканей путем присоединения двух различных флуорофоров в их конец.
Protocol
Разделы для молекулярной машины основе обнаружения должен быть подготовлен, так как их подготовка занимает больше времени, чем сборка молекулярные устройства. Построить хорошо работает с 5-6 мкм толщиной разделы, вырезанные из параформальдегида-фиксированных, парафин блоков ткани. Использование слайд брендов, которые сохраняют разделы, например, такие как ProbeOn Плюс заряжать и precleaned слайдов (Fisher Scientific) или аналогичный. Мы рекомендуем при первом использовании ткани с хорошо известной модели повреждений ДНК, которая содержит как ДНКазы I-и II-ДНКазы типа разрывов, такие как дексаметазон обработанных апоптоза крысы тимуса 13,14.
1. Подготовка разделов
- Место секций в стойку слайдов и депарафинизировать в ксилоле в течение 15 мин, трансфер в свежей ванне ксилол для дополнительных 5 минут.
- Увлажняет, проходя через градуированные концентрации этанола: 96% этанол-2x5min; 80% этанола - 5 минут, вода - 2x5 мин.
- Дайджест раздела ProteinasИспользование электронной К. 100 мкл 50μg/mL раствора на секции. Инкубировать 15 'при комнатной температуре (23 ° С) во влажной камере. Время, возможно, потребуется корректировка в зависимости от типа ткани. Жесткий тканей может потребоваться больше пищеварения. Времена 15-25 мин, как правило, используется. Недостаточность пищеварения, может привести к более слабым сигналом. Избытком, с другой стороны результаты в исчезновении сигнала и раздел разрушения.
- Промыть в дистиллированной воде в течение 2х10 мин.
- Применить 100 мкл на раздел 2% БСА для preblocking. Инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре (23 ° С). За это время собирать молекулярные машины.
2. Молекулярная сборка машин
Все реагенты масштабируются на 25 мкл общего объема, что достаточно для одной обнаружения в среднем срез ткани размера (10x10 мм). Объем может быть расширен по мере необходимости.
- Комбинат в небольшой пластиковой трубки в таком порядке:
|
- Осторожно перемешать с помощью пипетки. Молекулярной построить почти мгновенно самостоятельно собирает в этом растворе и может быть использован сразу при комнатной температуре (23 ° С). Повышение температуры до 37 ° C блоков Т4 ДНК-лигазы-компоненте маркировки.
3. Использование молекулярных машин, в срезах тканей двойного 5'OH этикетки и 5'PO4 разрывов ДНК
- Аспирируйте preblocking решение и применить 25 мкл полной смеси реакции, содержащие 70 пмоль олигонуклеотидных 1, 53 - 215 пмоль (1,76 - 7,1 мкг) VACCTOPO и 10 единиц T4 ДНК-лигазы (500 Ед / мл) в растворе из 66 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ MgCl 2, 0,1 ммоль dithioerythritol, 1 мМ АТФ, а 15% полиэтиленгликоля-8000. Же олигонуклеотидных последовательностей проведения одного FITC этикетки, олигонуклеотидов 2, может быть использован вместо для обнаружения одного типа разрывов ДНК. В таком случае опустить лигазы от маркировки реакции. Кроме того, в этой ситуации решение 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 15% ПЭГ-8000 может быть использован вместо Т4 ДНК-лигазы буфера.
- Выдержите в течение 1 часа при комнатной температуре (23 ° С) во влажной камере с пластиковыми покровным. Защищать от света. Понижение температуры до 16 ° C снижает лигазы основе сигнала, повышение температуры до 37 ° C полностью исключает лигазы основе сигнала. Частичное торможение лигазы иногда происходит в реакционную смесь, возможно, из-за загрязнения введена топоизомеразы препаратов. Таким образом, больше инкубационный (2-4 часов) может потребоваться особенно, когда сignificant числа лигазы меченных перерывы присутствуют. Хотя оба лигазы и топологический сигналы можно наблюдать на данном этапе, во многих случаях лигазы сигнал может быть дополнена путем повторного применения реакционной смеси без VACC TOPO и двойного меченых олигонуклеотидов, но содержащие шпильки формы олигонуклеотида (олигонуклеотидов 3) (35 мг / мл) и T4 ДНК-лигазы (250 ЕД / мл). Для усиления сигнала перейдите к шагу 3, чтобы увидеть реакцию без повышения перейдите к шагу 5.
- Удалить покровные, осторожно погружая слайды вертикально в банку Коплин содержащих воду при комнатной температуре. Аспирируйте лишнюю воду.
- Повышение лигазы сигнала с применением 25 мкл реакционной смеси без VACC TOPO и олигонуклеотида 1, но содержащих олигонуклеотидов 3: 66 мм-Tris HCl, рН 7,5, 5 мМ MgCl 2, 0,1 ммоль dithioerythritol, 1 мМ АТФ, а 15% полиэтиленгликоля- 8000, 5 единиц T4 ДНК-лигазы, 35 мг / мл олигонуклеотидов 3 (тупыми концами шпильки). Общий объем решение маркировки окн быть расширены для размещения больших разделов. Инкубируйте в течение 18 часов (на ночь) при комнатной температуре (23 ° С) во влажной камере с пластиковыми покровным.
- Удалить покровные, осторожно погружая слайды вертикально в Коплин сосуд, содержащий воду при комнатной температуре. Затем промыть разделе 3х10 мин в дистиллированной воде.
- Промыть натрия бикарбоната буфера. Щелочной раствор полоскания улучшает FITC флуоресценции, которая рН чувствительной и значительно снижается ниже рН 7.
- Защитный кожух с antifading решение (Vectashield с DAPI), покровное и анализа сигнала с помощью флуоресцентного микроскопа. Дважды цепи ДНК порывает с 5'OH будут светиться зеленым, 5'PO 4 отдых - будут светиться красным (рис. 2).
4. Представитель Результаты
Рисунок 1. Полу-искусственные молекулярные машины определяет два типаПовреждение ДНК на месте. Флуоресцентные машины самостоятельно собирает, когда VACC ТОПО связывается с двойным шпильки 32-Мер. Машина начинает работать, разделив себя на два блока детекторов с помощью топоизомеразы производства сократить на конец 3 'узнаваемой последовательности. Это приводит к циклическим процессом, в котором FITC-меченого единица непрерывно разделяет и religates обратно родамин-меченого единицы. Это сохраняется до перерыва обнаружить ДНК встречается. Когда такой альтернативный акцептор (5'OH тупым разрыв ДНК конца) присутствует в тканях разделе FITC часть будет перевязывать к нему. Остальные родамина часть будет приложить к 5 'PO 4 ДНК тупой конец перерывы с помощью T4 ДНК-лигазы. Следовательно, оба типа разрывов ДНК одновременно обнаружено.
Рисунок 2. Молекулярная машина двойного этикетки двух типов разрывов ДНКв срез ткани дексаметазона обработанных тимуса. Блант состава ДНК разрывы ДНКазы I-и II-ДНКазы типа обнаружены в областях коры тимуса апоптоза. Зеленый цитоплазматических флуоресценции (5'OH разрывов ДНК) знаменует корковых макрофаги переваривают ядерный материал апоптоза тимоцитов. Этот сигнал вырабатывается VACC TOPO и локализуется в phagolysosomes с ДНК, содержащей 5'OH двунитевых разрывов 11,12. Красный флуоресценции (5'PO 4 перерывами) этикетки ядер апоптоза тимоцитов не охвачен макрофагов. Массивные числа тимоцитов одновременно подвергаются апоптозу сопровождается генерацией 5'PO 4 двунитевых разрывов, визуализируются с помощью лигазы основе маркировки. Эти разрывы находятся на периферии ядра, образуя кольцевые узоры. Все клеточных ядер визуализируются на counterstaining с DAPI (синий флуоресценции).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом видео показано, как собрать и использовать двойной маркировки повреждений ДНК датчика. Датчик молекулярная машина управляется био-молекулярных двигателей, вирус-закодированного белка VACC ТОПО связаны с искусственным компонентов. Представлен пример развития био-включен подход, сторонники адаптации биологических структур, архитектуры и фактической части и компоненты клеток к дизайну нетоксичных молекулярных устройств масштаба 12,15. Такой подход решает две проблемы присущи области в естественных условиях наносенсоров: 1. трудности создания действительно единообразного и воспроизводимые нано-конструкций с помощью традиционных наноматериалов; и 2. потенциальной токсичности и высокой биологической реактивности нанозонды, частиц и другие высоко-дисперсных наноматериалов. Датчик объединяет естественные молекулярные машины с искусственными компонентами, которые перенаправляют его на новую функцию ДНК маркировки повреждений. Продукт такой интеграции является таковойМи-искусственные молекулярные машины, ориентированные на новые задачи. Хотя топоизомераз, полимеразы и других ферментных машины часто используется в биохимических исследованиях, они не интегрированы с инженерных приборов в отдельных молекулярных ансамблей. Следовательно, в их повседневного использования, они не используются в качестве полу-искусственные устройства 12.
Здесь мы покажем, как использовать датчик в формате срез ткани для одновременной маркировки ДНКазы I-и II-ДНКазы типа перерывов. Настоящее Есть никаких других методов, доступных для выполнения таких одновременных двойных обнаружения.
ДНКазы I-и II-ДНКазы типа перерывы важных маркеров клеточного смерти, в частности, маркировка апоптоза самостоятельной автономной и фагоцитарной фазы 11,16. Датчик полезным дополнением к арсеналу биомедицинских исследований, касающихся обнаружения и детальную характеристику апоптоза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом R01NS062842 из Национального института неврологических расстройств и инсульта, Национальные институты здравоохранения (ВСД) и грантами R21 NS064403 из Национального института неврологических расстройств и инсульта, Национальные институты здравоохранения через ARRA (ВСД) и R21 EB006301 Национального Института биомедицинской визуализации и биоинженерии, Национальные институты здравоохранения (ВСД).
References
- Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).
- Schuldt, A. Dynamic Pol expeditions. Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).
- Urry, D. W. Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).
- Schneider, T. D. Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines. J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).
- McClare, C. W. Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms. J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).
- Spirin, A. S. Ribosome as a molecular machine. FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).
- Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex. Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).
- Drexler, K. E. Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , Wiley. New York. (1992).
- Freitas, R. A. Nanomedicine: basic capabilities. , Landes Bioscience. Austin. (1999).
- Didenko, V. V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16, 4599-4614 (2011).
- Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection. Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).
- Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis. J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).
- Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells. Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).
- Jones, R. A. L. Soft Machines: Nanotechnology and life. , Oxford University Press. USA. (2007).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).
