Em Assembléia in vitro de Semi-artificial máquina molecular e sua utilização para detecção de danos no DNA

Summary

Nós demonstramos a montagem e aplicação de um dispositivo em escala molecular alimentado por uma proteína topoisomerase. A construção é um sensor de bio-molecular que rotula dois principais tipos de quebras de DNA em cortes de tecido, anexando dois fluoróforos diferentes para os seus fins.

Abstract

Naturalmente bio-molecular máquinas de trabalho em cada célula viva e exibir uma variedade de modelos ^06/01. No entanto, o desenvolvimento de centros artificial molecular máquinas em dispositivos capazes de movimento direcional, ou seja, motores moleculares, e sobre a sua escala reduzida partes mecânicas (rodas, eixos, etc pingentes) ^7-9. Este imita as máquinas macro-, mesmo que as propriedades físicas essenciais para estes dispositivos, tais como a inércia ea conservação do momento, não são utilizáveis ​​em ambientes nanoworld ^10. Projetos alternativos, que não seguem os esquemas mecânicos macromachines e usar mecanismos desenvolvidos na evolução de moléculas biológicas, pode aproveitar as condições específicas do mundo nano. Além disso, adaptando reais de moléculas biológicas para fins de nano-design reduz perigos em potencial dos produtos da nanotecnologia pode representar. Aqui demonstramos a montagem e aplicação de uma construção bio-enabled tais, comoemi-artificial dispositivo molecular que combina uma máquina molecular de ocorrência natural com componentes artificiais. Do ponto de vista enzimologia, a nossa construção é um designer complexo enzima-substrato fluorescente colocados juntos para executar uma função específica útil. Este conjunto é, por definição, uma máquina molecular, uma vez que contém um ^12. No entanto, sua integração com a parte de engenharia - hairpin dupla fluorescentes - re-direciona para uma nova tarefa de rotulagem danos no DNA ^12.

Nossa construção reúne a partir de um DNA 32-mer e uma enzima topoisomerase I vaccinia (VACC TOPO). A máquina então usa seu próprio material para fabricar duas unidades detector fluorescente etiquetado (Figura 1). Uma das unidades (fluorescência verde) carrega VACC TOPO covalentemente ligado a seu 3'end e outra unidade (fluorescência vermelha) é um hairpin livre com uma 3'OH terminal. As unidades são de curta duração e rapidamente montar de volta para a construção original, que posteriormente recleaves.Na ausência de DNA quebra estas duas unidades separadas de forma contínua e religate de uma forma cíclica. Em cortes de tecidos com danos no DNA, a unidade de transporte de detector topoisomerase seletivamente atribui a quebra ponta e DNA com 5'OH (DNase II tipo-breaks) ^11,12, fluorescente rotulá-los. O segundo, hairpin enzima livre formado após clivagem oligonucleotídeo, vai a uma ligadura 5'PO ₄ quebrar blunt-ended (DNase I tipo-breaks) ^11,12, se ligase T4 DNA está presente na solução ^13,14. Quando ligase T4 DNA é adicionado a uma secção de tecido ou uma solução contendo DNA com ₄ 5'PO ponta e breaks, a ligase reage com 5'PO _quatro extremidades do DNA, formando semi-estável da enzima DNA-complexos. Os grampos de cabelo sem corte terminou irá interagir com estes complexos liberando hairpins ligase e covalentemente ligados a DNA, assim rotulagem 5'PO _quatro breaks ponta e DNA.

Este desenvolvimento exemplifica uma nova abordagem prática para podesign e de máquinas moleculares e fornece um sensor de útil para a detecção de apoptose e dano de DNA em células fixas e tecidos.

Protocol

As seções para a detecção baseada em máquina molecular deve ser preparado em primeiro lugar porque a sua preparação leva mais tempo do que a montagem do dispositivo molecular. A construção funciona bem com 5-6μm de espessura, corte de paraformaldeído fixo, blocos de parafina do tecido. Use marcas de slides que retêm seções bem, como ProbeOn Além disso slides carregada e precleaned (Fisher Scientific) ou similar. Recomendamos em primeiro lugar usando um tecido com um padrão conhecido de dano ao DNA, que contém tanto DNase I e tipo II DNase-breaks, como a dexametasona tratadas com ratos apoptóticas timo ^13,14.

1. Preparação de seções

1. Coloque as seções em um rack de slides e dewax em xilol por 15 min, transferir para um banho de xileno fresco por mais 5 minutos.
2. Reidratar passando por concentrações de etanol classificados: 96% de etanol 2x5min; Etanol 80% - 5min; água - 2x5 min.
3. Digest seção com Proteínase K. Use 100μL de uma solução de 50μg/mL por seção. Incubar 15 'à temperatura ambiente (23 ° C) em câmara úmida. O tempo pode precisar de ajustes, dependendo do tipo de tecido. Tecidos duros pode exigir mais tempo de digestão. Vezes de 15-25 min são normalmente utilizados. Digestão insuficiente pode resultar no sinal mais fraco. Overdigestion na mão resulta no desaparecimento de sinais e interrupção seção.
4. Enxágüe em água destilada por min 2x10.
5. Adicionar 100 mL por seção da BSA 2% para preblocking. Incubar por 15 min à temperatura ambiente (23 ° C). Durante esse tempo, montar a máquina molecular.

2. Montagem máquinas moleculares

Todos os reagentes são escalados para 25 mL de volume total, que é suficiente para uma detecção única em uma seção média dimensão do tecido (10x10mm). O volume pode ser ampliado conforme a necessidade.

1. Combine em um pequeno tubo de plástico na seguinte ordem:

<tr>

Água bidestilada; Glicol-8000 de polietileno de 15%; Solução de 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 0,1 mM Ditioeritritol, 1 mM ATP, (ie tampão ligase regulares T4 DNA); 70 pmoles de Oligonucleotídeos 1, 215 pmoles (1,76-7,1 mg) VACC TOPO 10 unidades de T4 DNA ligase (500 U / mL)

2. Misture suavemente por pipetagem. A construção molecular quase instantaneamente auto-monta nesta solução e pode ser usado imediatamente em temperatura ambiente (23 ° C). Aumentando a temperatura para 37 ° C bloqueia a T4 DNA ligase componente baseado em matéria de rotulagem.

3. Utilização de máquinas moleculares em seções de tecido para 5'OH etiqueta dupla e 5'PO4 breaks DNA

1. Aspirar a solução preblocking e aplicar 25μL da mistura de reacção completa contendo 70 pmoles de Oligonucleotídeos 1, 53-215 pmoles (1,76-7,1 mg) VACCTOPO e 10 unidades de T4 DNA ligase (500 U / mL) em solução de 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, MgCl 5mM _2, 0,1 mM Ditioeritritol, 1 mM ATP, e polietileno glicol 15%-8000. O oligonucleotídeo mesma sequência carregando um único rótulo FITC, Oligonucleotide 2, pode ser usado para a detecção em vez de um único tipo de quebras de DNA. Em tal caso, omitir ligase a partir da reação rotulagem. Também nesta situação uma solução de 50 mM Tris-HCL, pH 7,4, 15% PEG-8000 pode ser usado em vez de tampão T4 DNA ligase.
2. Incubar por 1 hora em temperatura ambiente (23 ° C) em câmara úmida com uma lamela de plástico. Proteger da luz. Diminuição da temperatura para 16 ° C reduz o sinal ligase baseado, o aumento da temperatura a 37 ° C elimina completamente o sinal ligase-based. A inibição parcial da ligase às vezes ocorre na mistura de reação, possivelmente devido a contaminantes introduzidos com os preparativos topoisomerase. Portanto, mais de incubação (2-4 horas) pode ser necessária, especialmente quando snúmeros ignificant de ligase marcado breaks estão presentes. Embora ambos os ligase e sinais de topo pode ser observado nesta fase, em muitos casos o sinal ligase pode ser reforçada pela re-aplicação da mistura de reação sem VACC TOPO e Oligonucleotide dual-rotulados, mas contendo um oligonucleotídeo forma hairpin (Oligonucleotide 3) (35 mg / mL) e T4 DNA ligase (250 U / mL). Para melhorar sinal vá para a Etapa 3, para ver a reação, sem realce vá para o Passo 5.
3. Remove delicadamente lamínulas imergindo as lâminas verticalmente em uma jarra de Coplin contendo água à temperatura ambiente. Aspirar o excesso de água.
4. Melhorar sinal ligase através da aplicação de 25 mL de mistura de reação sem VACC TOPO e Oligonucleotide 1, mas contendo Oligonucleotide 3: 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl _2, 0,1 mM Ditioeritritol, 1 mM ATP, e polietileno glicol 15% 8000, 5 unidades de T4 DNA ligase, 35 de Oligonucleotídeos mg / mL 3 (blunt hairpin terminou). O volume total da solução de rotulagem can ser ampliados para acomodar as seções maiores. Incubar por 18 horas (overnight) em temperatura ambiente (23 ° C) em câmara úmida com uma lamela de plástico.
5. Remove delicadamente lamínulas imergindo as lâminas verticalmente em Coplin jar contendo água à temperatura ambiente. Em seguida, lave min seção 3x10 em água destilada.
6. Enxaguar com tampão bicarbonato de sódio. Solução alcalina lavar aumenta fluorescência FITC, que é sensível e pH é significativamente reduzido em pH abaixo de 7.
7. Cobrir seção com uma solução antifading (Vectashield com DAPI), lamela e analisar o sinal usando um microscópio de fluorescência. Quebra dupla vertente-DNA com 5'OH ficam verde-fluorescentes, 5'PO _quatro breaks - vai fluorescência vermelha (Figura 2).

4. Resultados representante

Figura 1. Semi-artificial máquina molecular detecta dois tipos deDanos ao DNA in situ. A máquina de auto-fluorescente quando monta VACC TOPO liga-se à dupla hairpin-32-mer. A máquina começa a operação, dividindo-se em duas unidades detector via topoisomerase-made corte na extremidade 3 'da seqüência de reconhecimento. Isso resulta em um processo cíclico onde a unidade de FITC-rotulados de forma contínua separa e volta para o religates rodamina marcado unidade. Este persiste até uma pausa DNA detectável é encontrado. Quando um receptor de tal alternativa (quebra de DNA 5'OH blunt end) está presente na seção de tecido, a parte FITC vai ligadura a ele. A parte restante rodamina serão anexados a 5 'PO ₄ DNA quebra extremidade sem corte com a ajuda do DNA ligase T4. Conseqüentemente, ambos os tipos de quebras de DNA são simultaneamente detectado.

Figura 2. Molecular rótulos máquina dual dois tipos de quebras de DNAem uma seção de tecido de dexametasona tratadas com timo. Blunt quebra-ended DNA de DNase I-II-e DNase tipo são detectados nas áreas cortical do timo em apoptose. Fluorescência citoplasmática verde (5'OH quebra de DNA) marca macrófagos cortical digerir material nuclear de timócitos apoptóticos. Este sinal é produzido por VACC TOPO, e localiza-se fagolisossomos com DNA contendo 5'OH dupla vertente-breaks ^11,12. Fluorescência vermelha (5'PO ₄ breaks) rótulos de núcleos de timócitos apoptóticos não engolida pelos macrófagos. Um enorme número de timócitos em apoptose simultaneamente acompanhada pela geração de ₄ 5'PO fita dupla-breaks, visualizado por ligase baseado rotulagem. Estas pausas estão localizadas na periferia nuclear, formando padrões em forma de anel. Todos os núcleos celulares são visualizados através da contracoloração com DAPI (azul fluorescente).

Discussion

Neste vídeo, demonstramos como montar e usar um dual-rotulagem sensor de danos ao DNA. O sensor é uma máquina molecular impulsionada por bio-molecular do motor, um vírus proteína codificada TOPO VACC ligados com componentes artificiais. O desenvolvimento apresentado exemplifica uma abordagem bio-enabled que defende a adaptação das estruturas biológicas, arquiteturas e peças e componentes reais de células para o projeto de não-tóxico dispositivos à escala molecular ^12,15. Esta abordagem resolve duas questões inerentes à área do nanosensores vivo: 1. a dificuldade de fazer verdadeiramente uniforme e reprodutível nano-constrói usando nanomateriais tradicionais; e 2. A toxicidade potencial, e reactividade biológica elevado de nanossondas, partículas e outros nanomateriais altamente dispersos. O sensor integra uma máquina de ocorrência natural com componentes moleculares artificiais que re-orientá-la para uma nova função de rotulagem de danos ao DNA. O produto dessa integração é um simi-artificial máquina molecular direcionados para uma nova tarefa. Enquanto topoisomerases, polimerases e outras máquinas enzimática são freqüentemente utilizados nas pesquisas bioquímicas, eles não estão integrados com componentes projetados em assembléias individuais molecular. Conseqüentemente, seu uso rotineiro, não são empregadas como semi-artificial dispositivos ^12.

Aqui nós mostramos como usar o sensor no formato de secção de tecido para a rotulagem simultânea de DNase I e tipo II DNase-breaks. Atualmente não existem outros métodos disponíveis para realizar a detecção simultânea como dual.

DNase I e tipo II DNase-breaks são importantes marcadores da progressão da morte celular, especificamente rotulagem as fases de auto-apoptóticos autônoma e fagocíticas ^11,16. O sensor é uma adição útil para a pesquisa biomédica arsenal lidar com a detecção e caracterização detalhada da apoptose.