Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

الجمعية في المختبر من نصف اصطناعية آلة الجزيئية واستخدامها للكشف عن الحمض النووي من التلف

Published: January 11, 2012 doi: 10.3791/3628
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Neurosurgery, Baylor College of Medicine, 2Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 3Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

نبدي التجمع وتطبيق جهاز الجزيئية النطاق مدعوم من البروتين topoisomerase. وبناء عبارة عن مستشعر الحيوية الجزيئية التي تصف نوعان رئيسيان من فواصل الحمض النووي في أقسام الأنسجة عن طريق ربط two fluorophores مختلفة لتحقيق غاياتهم.

Abstract

طبيعيا الحيوية الجزيئية آلات العمل في كل خلية حية وعرض مجموعة متنوعة من تصاميم 1-6. بعد تطوير مراكز صناعية آلات جزيئية على أجهزة قادرة على الحركة الاتجاه ، أي المحركات الجزيئية ، وعلى أجزاء مصغرة من الميكانيكية (العجلات ، الخ axels المعلقات ، و) 7-9. هذا يقلد آلات الكلي ، على الرغم من أن الخصائص الفيزيائية الأساسية لهذه الأجهزة ، مثل الجمود والحفاظ على الزخم ، ليست صالحة للاستعمال في البيئات nanoworld 10. ويمكن لتصاميم بديلة ، والتي لا تتبع مخططات macromachines الميكانيكية واستخدام الآليات المتقدمة في تطور الجزيئات البيولوجية ، والاستفادة من الشروط المحددة للnanoworld. الى جانب ذلك ، التكيف مع الجزيئات البيولوجية الفعلية لأغراض تصميم نانو يقلل المخاطر المحتملة لمنتجات تكنولوجيا النانو قد تشكل. نحن هنا لشرح التجمع وتطبيق واحد بناء الحيوية مكن من هذا القبيل ، كماEMI - الجزيئية الاصطناعية الجهاز الذي يجمع بين جهاز طبيعيا مع مكونات جزيئية اصطناعية. من وجهة نظر علم الإنزيمات ، وبناء لدينا هو مصمم الفلورسنت انزيم الركيزة المعقدة وضعت معا لأداء وظيفة محددة مفيدة. هذا التجمع هو تعريف الجهاز الجزيئي ، كما يحتوي على واحد 12. حتى الآن ، والتكامل مع الجزء هندسيا -- دبوس الشعر المزدوج فلوري -- إعادة توجهها إلى مهمة جديدة من الحمض النووي من التلف العلامات 12.

بناء تجمع لدينا من أصل 32 - DNA مير وtopoisomerase الوقس أنا انزيم (VACC TOPO). الجهاز ثم يستخدم المواد الخاصة بها الى افتعال حدتين كاشف fluorescently المسمى (الشكل 1). واحدة من وحدات (مخضر) يحمل VACC TOPO المرفقة تساهميا ل3'end وحدة أخرى (أحمر مضان) هو منعطف حاد الحرة مع 3'OH المحطة. وحدات قصيرة الأجل ويحشدوا بسرعة مرة أخرى إلى بناء الأصلي ، الذي recleaves في وقت لاحق.في غياب الحمض النووي فواصل هاتين الوحدتين منفصلة religate باستمرار وبطريقة دورية. في أقسام الأنسجة مع الحمض النووي من التلف ، وحدة للكشف عن topoisomerase الحاملة تعلق الحمض النووي بشكل انتقائي للفواصل حادة مع 5'OH العضوية (من النوع الثاني الدناز فواصل) 11،12 ، ووضع العلامات fluorescently لهم. الثانية ، انزيم خالية القاسي تشكلت بعد قليل النوكليوتيد الانقسام ، وسوف ligate لكسر 5'PO كليلة العضوية 4 (I - الدناز نوع فواصل) 11،12 ، إذا T4 يغاز الحمض النووي موجود في حل 13،14. عند إضافة T4 يغاز الحمض النووي لقسم الأنسجة أو محلول يحتوي على الحمض النووي مع فواصل حادة العضوية 5'PO 4 ، يغاز يتفاعل مع الحمض النووي تنتهي 5'PO 4 ، وتشكيل شبه مستقرة انزيم الدنا المجمعات. سوف دبابيس الشعر كليلة العضوية تتفاعل مع هذه المجمعات الافراج يغاز دبابيس الشعر ، وربط تساهميا إلى الحمض النووي ، وبالتالي وضع العلامات 5'PO 4 فواصل الحمض النووي كليلة العضوية.

هذا التطور تجسد نهجا جديدا لعملية ال(ه) من تصميم الآلات الجزيئية ويوفر جهاز استشعار مفيدة للكشف عن الخلايا والحمض النووي الضرر في الخلايا والأنسجة الثابتة.

Protocol

وينبغي أن تكون على استعداد للكشف عن أجزاء الجهاز المستندة الجزيئية أولا لأن إعدادها وقتا أكثر من تجميع الجهاز الجزيئي. وبناء يعمل بشكل جيد مع 5 أبواب 6μm سميكة من قطع بارافورمالدهيد الثابتة ، وكتل البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج. استخدام العلامات التجارية الشريحة التي تحتفظ المقاطع أيضا ، مثل الشرائح ProbeOn زائد واتهم precleaned (فيشر العلمي) أو ما شابه ذلك. نوصي به لأول مرة في الأنسجة مع نمط معروف من الحمض النووي من التلف الذي يحتوي على كل الدناز I - II الدناز وفواصل من نوع ، مثل ديكساميثازون الفئران المعالجة أفكارك التوتة 13،14.

1. إعداد الأبواب

  1. وضع المقاطع في رف الشريحة وdewax في الزيلين لمدة 15 دقيقة ، ونقل إلى حمام الزيلين الطازجة لمدة 5 دقائق إضافية.
  2. ترطيب بعبورها تركيزات الإيثانول متدرج : 96 ٪ الايثانول 2x5min ؛ الايثانول 80 ٪ -- 5min ، والمياه -- 2x5 دقيقة.
  3. هضم المقطع مع Proteinasه ك استخدم 100μL حل 50μg/mL في القسم. احتضان 15 'في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) في غرفة ترطيب. قد تحتاج إلى وقت للتكيف وفقا لنوع الأنسجة. قد تتطلب الأنسجة الصلبة تعد عملية الهضم. وعادة ما تستخدم أوقات 15-25 دقيقة. قد يؤدي إلى عدم كفاية الهضم الأضعف إشارة. Overdigestion على نتائج ناحية أخرى في اختفاء الإشارات وتعطل القسم.
  4. شطف في الماء المقطر ل2x10 دقيقة.
  5. تطبيق القسم 100 ميكروليتر في المائة من 2 ٪ لجيش صرب البوسنة preblocking. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية). خلال هذا الوقت تجميع الجهاز الجزيئي.

2. آلات التجمع الجزيئي

يتم تحجيم كل الكواشف لحجم إجمالي 25 ميكرولتر ، وهو ما يكفي للكشف عن واحد في المقطع حجم الأنسجة المتوسط ​​(10x10mm). ويمكن تحجيمها ورفع الصوت حسب الحاجة.

  1. تجمع في أنبوب بلاستيكي صغير في هذا النظام :
<TR>
  1. Bidistilled المياه ؛
  2. 15 ٪ البولي ايثيلين جلايكول - 8000 ؛
  3. الحل من 66 ملم تريس حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.5 ، 5 مم MgCl 2 ، 0.1 ملم dithioerythritol ، 1 ملم اعبي التنس المحترفين ، (أي الحمض النووي العادية يغاز T4 العازلة) ؛
  4. 70 pmoles من قليل النوكليوتيد 1 ،
  5. 215 pmoles (1،76-7،1 ميكروغرام) VACC TOPO
  6. 10 وحدات الحمض النووي يغاز T4 (500 U / مل)
  1. المزيج بلطف pipetting. الجزيئي بناء على الفور تقريبا الذاتي تجمع في هذا الحل ، ويمكن استخدامها على الفور في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية). زيادة درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية يمنع T4 يغاز الحمض النووي القائم على العناصر المكونة لوضع العلامات.

3. باستخدام الآلات الجزيئية في أقسام الأنسجة ل5'OH التسمية المزدوجة وفواصل الحمض النووي 5'PO4

  1. نضح الحل preblocking 25μL وتطبيق مزيج من التفاعل الكامل تحتوي على 70 من pmoles قليل النوكليوتيد 1 ، 53-215 pmoles (1،76-7،1 ميكروغرام) VACCTOPO وحدات الحمض النووي يغاز 10 T4 (500 U / مل) في محلول من حمض الهيدروكلوريك 66 ملم تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 ، MgCl 5mM 2 ، 0.1 ملم dithioerythritol ، 1 ملم اعبي التنس المحترفين ، والبولي ايثيلين جلايكول 15 ٪ - 8000. وقليل النوكليوتيد نفس تسلسل تحمل تسمية واحدة FITC ، قليل النوكليوتيد 2 ، يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك للكشف عن نوع واحد من فواصل الحمض النووي. في مثل هذه الحالة يغاز حذفت من ردود فعل التوسيم. أيضا في هذه الحالة يمكن إيجاد حل ل50mM تريس - HCL ، ودرجة الحموضة 7.4 ، يمكن استخدام 15 ٪ PEG - 8000 بدلا من الحمض النووي T4 يغاز العازلة.
  2. احتضان لمدة 1 ساعة على درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) في غرفة ترطيب مع ساترة البلاستيك. بعيدا عن الضوء. خفض درجة الحرارة إلى 16 درجة مئوية يقلل إشارة يغاز مقرها ، وارتفاع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية يزيل تماما الإشارة يغاز مقرا لها. وتثبيط جزئي ليغاز يحدث أحيانا في مزيج التفاعل ، وربما بسبب الملوثات المقدمة مع الاستعدادات topoisomerase. لذا ، قد يكون مطلوبا حضانة أطول (2-4 ساعات) خصوصا عندما قأرقام ignificant من يغاز المسمى فواصل موجودة. على الرغم من أن يمكن ملاحظة كلا يغاز وإشارات توبو في هذه المرحلة ، في كثير من الحالات يمكن الإشارة يغاز يتعزز من خلال تطبيق إعادة المزيج من دون رد فعل TOPO VACC وصفت قليل النوكليوتيد المزدوجة ، ولكن يحتوي على قليل النوكليوتيد شكل دبوس (قليل النوكليوتيد 3) (35 ملغ / مل) و T4 يغاز الحمض النووي (250 U / مل). لتعزيز إشارة المضي قدما إلى الخطوة 3 ، لمعرفة رد الفعل من دون تعزيز انتقل إلى الخطوة 5.
  3. إزالة coverslips بغمر بلطف الشرائح عموديا في وعاء يحتوي على الماء Coplin في درجة حرارة الغرفة. نضح المياه الزائدة.
  4. تعزيز إشارة يغاز من خلال تطبيق 25 ميكرولتر من دون رد فعل مزيج TOPO VACC وقليل النوكليوتيد 1 ، ولكن تحتوي على قليل النوكليوتيد 3 : 66 ملم تريس حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.5 ، 5 مم MgCl 2 ، 0.1 ملم dithioerythritol ، 1 ملم اعبي التنس المحترفين ، و- غليكول البولي ايثيلين بنسبة 15 ٪ 8000 ، 5 وحدات الحمض النووي يغاز T4 ، و 35 ملغ / مل قليل النوكليوتيد 3 (كليلة القاسي انتهى). الحجم الكلي للوسم حل كاليفورنيايمكن تحجيمها ن يصل إلى استيعاب أكبر أقسام. احتضان لمدة 18 ساعة (بين عشية وضحاها) في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) في غرفة ترطيب مع ساترة البلاستيك.
  5. إزالة coverslips بغمر بلطف الشرائح عموديا في جرة Coplin تحتوي على الماء في درجة حرارة الغرفة. دقيقة ثم يغسل القسم 3x10 في الماء المقطر.
  6. التشطيف مع العازلة بيكربونات الصوديوم. محلول قلوي شطف يعزز FITC مضان ، وهي حساسة ويتم تخفيض درجة الحموضة أقل بكثير من درجة الحموضة 7.
  7. تغطية الجزء بمحلول antifading (Vectashield مع دابي) ، ساترة وتحليل الإشارات باستخدام المجهر الفلورسنت. سوف فواصل الحمض النووي المزدوج حبلا 5'OH يتألق مع الأخضر ، فواصل 5'PO 4 -- سوف يتألق باللون الأحمر (الشكل 2).

4. ممثل النتائج

الشكل 2.
الشكل 1. شبه آلة جزيئية اصطناعية يكشف نوعين منالحمض النووي من التلف في الموقع. الجهاز الفلورسنت الذاتي عندما تجمع VACC TOPO بربط القاسي مزدوجة - 32 - سورمير. يبدأ تشغيل الجهاز عن طريق تقسيم نفسها إلى وحدات للكشف عن يومين عبر topoisomerase صنع قطع في نهاية 3 'من تسلسل الاعتراف. هذه النتائج في عملية دورية حيث وحدة FITC المسمى يفصل باستمرار وreligates العودة إلى الوحدة ، رودامين المسمى. استمر ذلك حتى يتم كسر اجه الحمض النووي للكشف. عندما يكون هذا متقبل البديلة (DNA 5'OH نهاية حادة كسر) موجود في قسم الأنسجة ، فإن الجزء FITC ligate إليه. والجزء المتبقي رودامين نعلق على 5 'فواصل الحمض النووي ص 4 نهاية صريحة مع مساعدة من الحمض النووي يغاز T4. وبالتالي ، يتم الكشف في وقت واحد كلا النوعين من فواصل الحمض النووي.

الشكل 1.

الشكل 2. تسميات آلة الجزيئية المزدوجة نوعين من فواصل الحمض النوويفي مقطع من أنسجة الغدة الصعترية ديكساميثازون المعاملة. فواصل الحمض النووي كليلة العضوية للالدناز يتم الكشف عن الدناز I - II - واكتب في المناطق القشرية التوتة تمر موت الخلايا المبرمج. مضان هيولي خضراء (DNA 5'OH فواصل) علامات الضامة القشرية هضم المواد النووية من thymocytes أفكارك. ويتم إنتاج هذه الإشارة التي TOPO VACC ، ويموضع لphagolysosomes مع الحمض النووي يحتوي على 5'OH مزدوج الجديلة 11،12. مضان أحمر (4 5'PO فواصل) تسميات نوى thymocytes أفكارك لا اجتاحت بواسطة الضامة. أعداد هائلة من الخلايا في وقت واحد thymocytes الخضوع يرافقه جيل من 4 فواصل المزدوج حبلا 5'PO ، التي تصور يغاز المستندة إلى وضع العلامات. وتقع هذه الانقطاعات على هامش النووية ، وتشكيل عصابة على شكل أنماط. جميع النوى الخلوية هي التي تصور counterstaining مع دابي (الأزرق مضان).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية تجميع واستخدام الحمض النووي الوسم المزدوج استشعار الضرر. المجس هو آلة جزيئية مدفوعا الحيوية الجزيئية المحرك ، وهو فيروس ترميز TOPO VACC البروتين المرتبط مع مكونات اصطناعية. وقدم مثالا على تطوير نهج الحيوي الذي مكن دعاة تكييف الهياكل البيولوجية ، وأبنية وقطع الغيار والمكونات الفعلية للخلايا في تصميم الأجهزة غير سامة 12،15 المستوى الجزيئي. هذا النهج على حل مسألتين الأصيل في مجال nanosensors في الجسم الحي : 1. صعوبة اتخاذ موحدة حقا واستنساخه نانو يبني باستخدام مواد متناهية الصغر التقليدية ؛ و 2. سمية المحتملة ، وتفاعلية عالية من الجزيئات البيولوجية ، وغيرها من المواد متناهية الصغر nanoprobes عالية المشرد. ويدمج جهاز استشعار طبيعيا مع المكونات الجزيئية الاصطناعية التي يعاد توجيهها إلى وظيفة جديدة من الحمض النووي من التلف الوسم. نتاج هذا الاندماج هو ذاتهMI - الاصطناعية آلة الجزيئية التي تستهدف مهمة جديدة. في حين يتم استخدامها بشكل متكرر topoisomerases ، polymerases والآلات الأخرى الأنزيمية في الأبحاث البيوكيميائية ، لا يتم دمجها مع المكونات المهندسة في التجمعات الجزيئية الفردية. وبالتالي في استخدام روتين حياتهم ، لا يتم توظيفهم في الأجهزة شبه اصطناعية 12.

هنا نبين كيفية استخدام أجهزة الاستشعار في النسيج تنسيق المقطع لوصفها المتزامن لالدناز I - II - والدناز نوع فواصل. في الوقت الحاضر لا توجد وسائل أخرى متاحة لتنفيذ مثل هذا الكشف في وقت واحد مزدوج.

الدناز I - II الدناز وفواصل من نوع هي علامات مهمة من تطور موت الخلايا ، ووضع العلامات على وجه التحديد المراحل أفكارك الذاتية الحكم الذاتي وأكلة 11،16. المجس هو إضافة مفيدة إلى ترسانة البحوث الطبية الحيوية تتعامل مع كشف وتوصيف مفصل لموت الخلايا المبرمج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث من خلال منحة R01NS062842 من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية والمعاهد الوطنية للصحة (الليبرالي) ، ومنح R21 NS064403 من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية والمعاهد الوطنية للصحة من خلال الأذربيجانية (الليبرالي) و R21 EB006301 المعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية والمعاهد الوطنية للصحة (الليبرالي).

References

  1. Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).
  2. Schuldt, A. Dynamic Pol expeditions. Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).
  3. Urry, D. W. Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).
  4. Schneider, T. D. Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines. J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).
  5. McClare, C. W. Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms. J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).
  6. Spirin, A. S. Ribosome as a molecular machine. FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).
  7. Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex. Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).
  8. Drexler, K. E. Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , Wiley. New York. (1992).
  9. Freitas, R. A. Nanomedicine: basic capabilities. , Landes Bioscience. Austin. (1999).
  10. Didenko, V. V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).
  11. Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16, 4599-4614 (2011).
  12. Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection. Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).
  13. Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis. J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).
  14. Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells. Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).
  15. Jones, R. A. L. Soft Machines: Nanotechnology and life. , Oxford University Press. USA. (2007).
  16. Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 59 ، آلة الجزيئية ، البيولوجية وتكنولوجيا النانو ، فواصل الحمض النووي 5'OH ، فواصل الحمض النووي 5'PO4 ، ووضع العلامات موت الخلايا المبرمج ، في الكشف عن الموقع ، الوقس topoisomerase الأول ، فواصل الحمض النووي ، وتكنولوجيا النانو الخضراء
الجمعية <em>في المختبر</em> من نصف اصطناعية آلة الجزيئية واستخدامها للكشف عن الحمض النووي من التلف
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Minchew, C. L., Didenko, V. V.… More

Minchew, C. L., Didenko, V. V. In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage. J. Vis. Exp. (59), e3628, doi:10.3791/3628 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter