Demostramos la asamblea y la aplicación de un dispositivo a escala molecular, alimentado por una proteína de la topoisomerasa. La construcción es un sensor bio-molecular que las etiquetas de dos grandes tipos de ADN se rompe en secciones de tejido uniendo dos fluoróforos diferentes a sus fines.
De origen natural bio-molecular máquinas trabajan en todas las células vivas y mostrar una gran variedad de diseños 1-6. Sin embargo, el desarrollo de máquinas moleculares artificiales centros de dispositivos con capacidad de movimiento direccional, es decir, los motores moleculares, y en su reducida partes mecánicas (ruedas, ejes, etc colgantes) 7-9. Esto imita las máquinas macro-, a pesar de que las propiedades físicas esenciales para estos dispositivos, como la inercia y la conservación del momento, no se pueden usar en los entornos nanomundo 10. Diseños alternativos, que no siguen los esquemas mecánicos macromachines y utilizar los mecanismos desarrollados en la evolución de las moléculas biológicas, pueden tomar ventaja de las condiciones específicas del nanomundo. Además, la adaptación real de las moléculas biológicas con fines de nano-diseño reduce los peligros potenciales de los productos la nanotecnología puede plantear. Aquí se demuestra el montaje y la aplicación de uno de estos bio-permitió construir, comoemi-artificial dispositivo molecular que combina una máquina molecular de origen natural con componentes artificiales. Desde el punto de vista de la enzimología, nuestra construcción es un diseñador fluorescentes complejo enzima-sustrato juntos para realizar una función útil específica. Este conjunto es, por definición, una máquina molecular, ya que contiene un 12. Sin embargo, su integración con la parte de ingeniería – horquilla de doble fluorescente – que re-dirige a una nueva tarea de etiquetado daño en el ADN 12.
Nuestra construcción ensambla de un ADN de 32-mer y una enzima topoisomerasa I vaccinia (VACC TOPO). La máquina usa su propio material para la fabricación de dos unidades de la etiqueta fluorescente detector (Figura 1). Una de las unidades (fluorescencia verde) lleva VACC TOPO covalentemente a su extremo 3 'y la otra unidad (fluorescencia roja) es una horquilla libre con un 3'OH terminal. Las unidades son de corta duración y rápidamente montamos de nuevo en la construcción original, que posteriormente recleaves.En la ausencia de ADN se rompe estas dos unidades separadas y religate continuamente de una manera cíclica. En secciones de tejido con daño en el ADN, el detector de la topoisomerasa-llevar selectivamente se une a roturas en el ADN de extremos romos con 5'OH (DNasa II-tipo se rompe) 11,12, con fluorescencia que el etiquetado. El segundo, sin enzimas horquilla formada después de la escisión de oligonucleótidos, se ligan a un 5'PO 4 romos break (DNasa I-tipo se rompe) 11,12, si la ADN ligasa de T4 está presente en la solución de 13,14. Cuando la ADN ligasa de T4 se añade a una sección de tejido o una solución que contiene ADN con 5'PO cuatro extremos romos se rompe, la ligasa reacciona con 5'PO cuatro extremos de ADN, formando semi-estable enzima ADN complejos. Las horquillas romos va a interactuar con estos complejos de la liberación de ganchos para el cabello ligasa y la vinculación covalente al ADN, por lo que el etiquetado 5'PO 4 romos roturas en el ADN.
Este desarrollo es un ejemplo de un nuevo enfoque práctico ªdiseño e de máquinas moleculares y ofrece un sensor de útiles para la detección de la apoptosis y el daño del ADN en las células y los tejidos fijos.
En este video, que muestra cómo montar y utilizar un doble marcaje de ADN sensor de daño. El sensor es una máquina molecular impulsado por bio-molecular del motor, un virus-proteína codificada TOPO VACC vinculados con componentes artificiales. El desarrollo presenta un ejemplo de un enfoque bio-permitió que aboga por la adaptación de las estructuras biológicas, arquitecturas y piezas reales y los componentes de las células en el diseño de productos no tóxicos dispositivos a escala molecular 12,15. E…
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue apoyada por conceder R01NS062842 del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares de los Institutos Nacionales de Salud (VVD) y por las subvenciones R21 NS064403 del Instituto Nacional de Desórdenes Neurológicos y Derrame Cerebral Instituto Nacional de Salud a través de la ARRA (VVD) y R21 EB006301 Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería, Instituto Nacional de Salud (VVD).
5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT RAT GCG TT- 3′; F – FITC-dT; R – Tetramethylrhodamine-dT. Other red-shifted fluorophores such as BODIPY TR, rhodamine or TAMRA can be used instead of tetramethylrhodamine as R.
Alternatively you can use Oligonucleotide 2 – a double-hairpin single labeled with fluorescein (for detection of a single type of DNA breaks (DNase II-type only). The single-fluorophore-carrying probe is considerably less expensive and is convenient whenever a single type of DNA break is to be labeled: 5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3′; F – FITC-dT