DNA 손상 감지를위한 세미 인공 분자 기계 및 이용 체외 조립에

Summary

우리는 topoisomerase 단백질에 의해 구동되는 분자 규모의 장치의 조립 및 응용 프로그램을 보여줍니다. 구조는 끝이 두 가지 다른 fluorophores을 첨부하여 조직 섹션에서 DNA 나누기의 두 가지 주요 유형의 레이블 생체 분자 센서이다.

Abstract

자연스럽게 발생하는 생체 분자 기계는 모든 살아있는 세포에서 작업과 디자인 ^1-6 다양한 표시됩니다. 그러나 방향 운동, 즉 분자 모터 수있는 장치에 대한, 그들의 스케일 다운 기계 부품 (바퀴, axels, 펜던트 등) ^7-9에서 인공 분자 기계 센터의 개발. 이것은 관성과 운동량 보존 이러한 장치에 대한 필수적인 물리적 속성, nanoworld 환경 ¹⁰ 사용할 수없는 경우에도 매크로 시스템을 imitates. 기계 macromachines 계획에 따라 생물 학적 분자의 진화에 개발한 메커니즘을 사용하지 않는 대체 디자인, nanoworld의 특정 조건을 활용할 수 있습니다. 게다가, 나노 디자인의 목적을 위해 실제 생물 학적 분자를 채택하면 나노 제품 포즈 수있는 잠재적인 위험을 줄여줍니다. 여기는, 하나의 바이오 기반 구조의 조립 및 애플 리케이션을 설명인공 구성 요소와 자연 – 발생 분자 기계를 결합하여 EMI – 인공 분자 장치. 보기의 enzymology 지점에서, 우리의 구조는 디자이너 형광 효소 – 기질 복합 특정 유용한 기능을 수행하기 위해 함께 들어가게된다. 그 하나의 ^12가 들어 있으므로이 어셈블리는 정의에 의해 분자 기계입니다. 그러나, 설계 부분와의 통합 – 형광 듀얼 머리 핀의 자형 – DNA 손상 ¹² 라벨링의 새로운 작업에 다시 번 지휘하고 있습니다.

우리의 구조는 32 메르 DNA와 효소 우두 topoisomerase I (VACC TOPO)의 밖으로 조립. 기계 후 두 찬란 표시 검출기 단위 (그림 1)를 조작하기 위해 자신의 소재를 사용합니다. 단위 중 하나는 (녹색 형광) covalently의 3'end와 다른 장치 (적색 형광)에 연결된 VACC TOPO가 터미널 3'OH와 함께 무료로 머리핀입니다시킵니다. 단위도 잊혀하고 신속 이후 recleaves 원래 구조로 다시 재조 립.DNA의 부재에서는 순환 방식으로 연속적으로 분리하여 religate이 두 단위 나옵니다. DNA 손상, topoisomerase 운반 검출기 단위 선택 찬란를 라벨, 5'OH (DNase II 타입 나누기) ^11,12과 무딘 엔드의 DNA 휴식에 부착과 조직 섹션에. T4 DNA ligase에이 솔루션 ^{13,14에있는} 경우 oligonucleotide 절단 후 형성 둘째, 효소 – 무료 머리핀은 5'PO ₄ 무딘 엔드 휴식 (DNase I – 타입 휴식) ^11,12에 ligate 것입니다. T4 DNA ligase의가 조직의 섹션 또는 5'PO ₄ 무딘 엔드 휴식과 DNA를 포함하는 솔루션에 추가되면, ligase 준 안정 효소 – DNA의 단지를 형성, 5'PO _네 DNA 종료와 함께 반응. 무딘 종료된 헤어핀 따라서 5'PO ₄ 무딘 엔드의 DNA 나누기를 라벨, DNA에 ligase와 covalently 연결 헤어핀를 방출이 단지와 상호 작용합니다.

이 개발 일에 새로운 실용적인 접근 방식을 exemplifies전자 분자 기계의 설계 및 고정 세포 및 조직에서 apoptosis와 DNA 손상의 검출에 유용한 센서를 제공합니다.

Protocol

자신의 준비는 분자 장치의 조립보다 더 많은 시간을 소요하기 때문에 분자 기계 기반의 탐지에 대한 부분 먼저 준비되어야합니다. 구조는 paraformaldehyde – 고정, 파라핀 – 임베디드 조직 블록에서 컷 5 6μm 두께 부분과 잘 작동합니다. 이러한 ProbeOn 플러스 충전 및 precleaned 슬라이드 (피셔 과학) 또는 유사한뿐만 아니라 섹션을 유지 슬라이드 브랜드를 사용합니다. 우리는 최초의 dexamethasone – apoptotic ?…

Discussion

이 비디오에서는, 우리는 이중 라벨의 DNA 손상 센서를 조립하고 사용하는 방법을 보여줍니다. 센서는 생체 분자 엔진, 인공 구성 요소와 연결된 바이러스 인코딩된 단백질 VACC의 TOPO에 의한 분자 기계입니다. 표시 개발 무독성 분자 규모의 장치 ^12,15의 디자인에 생물 학적 구조, 아키텍쳐 및 세포의 실제 부품과 구성 요소를 채택 옹호 생체 활성화된 접근 방식을 exemplifies. 1 :이 방법은 ?…

Materials

1. Xylene
2. 80 and 96% Ethanol.
3. 2% solution of bovine serum albumin (BSA) in distilled water.
4. Oligonucleotide 1: a double-hairpin, dual labeled with fluorescein and tetramethylrhodamine:

5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT RAT GCG TT- 3′; F – FITC-dT; R – Tetramethylrhodamine-dT. Other red-shifted fluorophores such as BODIPY TR, rhodamine or TAMRA can be used instead of tetramethylrhodamine as R.

Alternatively you can use Oligonucleotide 2 – a double-hairpin single labeled with fluorescein (for detection of a single type of DNA breaks (DNase II-type only). The single-fluorophore-carrying probe is considerably less expensive and is convenient whenever a single type of DNA break is to be labeled: 5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3′; F – FITC-dT

5. Oligonucleotide 3. Blunt-ended rhodamine-labeled hairpin for enhancement of in situ ligation signal with T4 DNA ligase: 5′-GCG CTA GAC CRG GTC TAG CGC-3′; R – Tetramethylrhodamine-dT
6. Vaccinia DNA topoisomerase l (VACC TOPO) – 3000 U/μL (Vivid Technologies). In the initial experiments we used 215 pmoles (7.1 μg) of the VACC TOPO per every 25 μL of the reaction mix. However, the topoisomerase concentration can be significantly reduced without the loss of sensitivity. We later used a four times lesser amount of VACC TOPO per section (1.76 μg in 25 μL of the reaction mix per section) with similar results. Reducing amount of the enzyme to 880 ng (in 25 μL of the reaction mix) resulted in a weaker signal and 8.8 ng of VACC TOPO produced no detectable signal.
7. T4 DNA ligase 5 U/μL (Roche). This highly concentrated ligase preparation gives the best signal in our experimental conditions.
8. 10 x reaction buffer for T4 DNA ligase: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl₂, 10 mM dithioerythritol, 10 mM ATP, pH 7.5 (20° C) (Roche) . ATP in reaction buffer is easily destroyed in repetitive cycles of thawing-freezing. Aliquot the buffer in small 15-20 μL portions and store at – 20° C. Use once.
9. 30% (w/v) solution of PEG-8000 (Sigma) in bidistilled water. 15 % PEG-8000 in the reaction mix strongly stimulates the detection, increasing the effective concentrations of its constituents by volume exclusion.
10. Proteinase K (Roche) 20 mg/mL stock solution in distilled water. Store at – 20° C. In the reaction use 50mg/mL solution in PBS, prepared from the stock. Do not reuse.
11. Vectashield with DAPI (Vector Laboratories).
12. Sodium bicarbonate buffer: 50mM NaHCO₃, 15mM NaCl, pH 8.2.
13. 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section.