In Assemblea in vitro di semi-artificiale della macchina molecolare e il suo utilizzo per il rilevamento del danno al DNA

Summary

Dimostriamo il montaggio e l'applicazione di una scala molecolare dispositivo alimentato da una proteina topoisomerasi. Il costrutto è un bio-sensore molecolare che le etichette due tipi principali di rotture del DNA nelle sezioni di tessuto allegando due fluorofori diversi per i loro fini.

Abstract

Naturale bio-molecolari macchine lavorano in ogni cellula vivente e visualizzare una varietà di disegni ^1-6. Eppure lo sviluppo di macchine molecolari artificiali centri su dispositivi in grado di movimento direzionale, cioè motori molecolari, e sulla loro parti meccaniche in scala ridotta (ruote, assali, ecc pendenti) ^7-9. Questo imita la macro-macchine, anche se le proprietà fisiche fondamentali per questi dispositivi, come ad esempio inerzia e conservazione del momento, non sono utilizzabili in ambienti nanomondo ^10. Progetti alternativi, che non seguono gli schemi meccanici macromachines e utilizzare meccanismi sviluppati per l'evoluzione delle molecole biologiche, possono usufruire delle condizioni specifiche del nanomondo. Inoltre, adattando reale molecole biologiche ai fini della nano-design riduce i pericoli potenziali dei prodotti delle nanotecnologie potrebbero comportare. Qui mostriamo il montaggio e l'applicazione di uno di questi bio-enabled costruire, comeemi-artificiale dispositivo molecolare che combina una macchina in natura molecolare con componenti artificiali. Dal punto di vista enzimologia, il nostro costruire è una fluorescente progettista enzima-substrato complesso mettere insieme per svolgere una specifica funzione utile. Questa assemblea è per definizione una macchina molecolare, in quanto contiene un ^12. Eppure, la sua integrazione con le progettato parte – fluorescenti a doppio tornante – ha re-indirizza a una nuova attività di etichettatura danno al DNA ^12.

Il nostro costruire assembla da un 32-mer DNA e un enzima vaccino topoisomerasi I (VACC TOPO). La macchina utilizza poi il proprio materiale per fabbricare due unità rivelatore fluorescente (Figura 1). Una delle unità (fluorescenza verde) porta VACC TOPO covalentemente legata al suo 3'end e un'altra unità (fluorescenza rossa) è un tornante libero con un 3'OH terminale. Le unità sono di breve durata e rimontare rapidamente nuovamente dentro il costrutto originale, che recleaves successivamente.In assenza di rotture del DNA queste due unità separate e in continuo religate in modo ciclico. In sezioni di tessuto con danno al DNA, la topoisomerasi che trasportano unità di rilevatore si attacca selettivamente a blunt-ended con 5'OH rotture del DNA (DNasi II di tipo break) ^11,12, fluorescente loro etichettatura. Il secondo, enzima senza tornante formata a seguito della scissione oligonucleotidi, sarà legare ad un 5'PO ₄ smussato-ended break (DNasi I di tipo break) ^11,12, se il DNA ligasi T4 è presente nella soluzione ^13,14. Quando il DNA ligasi T4 viene aggiunto a una sezione di tessuto o di una soluzione contenente DNA con 5'PO ₄ blunt-ended pause, la ligasi reagisce con 5'PO ₄ estremità del DNA, formando semi-stabile enzima-DNA complessi. I tornanti smussato conclusa potranno interagire con questi complessi rilasciando tornanti ligasi e il collegamento covalente al DNA, così etichettatura 5'PO ₄ blunt-ended rotture del DNA.

Questo sviluppo esemplifica un nuovo approccio pratico °progettazione e di macchine molecolari e fornisce un utile sensore per il rilevamento di apoptosi e danno al DNA nelle cellule e nei tessuti fissi.

Protocol

Le sezioni per la macchina molecolare basata rilevamento deve essere preparato prima perché la loro preparazione richiede più tempo rispetto l'assemblaggio del dispositivo molecolare. Il costrutto funziona bene con 5-6μm dello spessore di sezioni tagliate da paraformaldeide-fisso, inclusi in paraffina blocchi di tessuto. Utilizzare i marchi scivolo che mantengono sezioni e, come ProbeOn Inoltre diapositive carica e predepurata (Fisher Scientific) o simili. Si consiglia in un primo momento con un tessuto con un no…

Discussion

In questo video mostriamo come assemblare e utilizzare un dual-etichettatura DNA sensore danni. Il sensore è una macchina molecolare guidata da bio-molecolari motore, un virus-encoded TOPO VACC proteina legata con componenti artificiali. Lo sviluppo ha presentato l'esempio di un bio-enabled approccio che promuove l'adattamento delle strutture biologiche, architetture e componenti effettivi e dei componenti delle cellule alla progettazione di atossici dispositivi su scala molecolare ^12,15. Questo appr…

Materials

1. Xylene
2. 80 and 96% Ethanol.
3. 2% solution of bovine serum albumin (BSA) in distilled water.
4. Oligonucleotide 1: a double-hairpin, dual labeled with fluorescein and tetramethylrhodamine:

5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT RAT GCG TT- 3′; F – FITC-dT; R – Tetramethylrhodamine-dT. Other red-shifted fluorophores such as BODIPY TR, rhodamine or TAMRA can be used instead of tetramethylrhodamine as R.

Alternatively you can use Oligonucleotide 2 – a double-hairpin single labeled with fluorescein (for detection of a single type of DNA breaks (DNase II-type only). The single-fluorophore-carrying probe is considerably less expensive and is convenient whenever a single type of DNA break is to be labeled: 5′-AAG GGA CCT GCF GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3′; F – FITC-dT

5. Oligonucleotide 3. Blunt-ended rhodamine-labeled hairpin for enhancement of in situ ligation signal with T4 DNA ligase: 5′-GCG CTA GAC CRG GTC TAG CGC-3′; R – Tetramethylrhodamine-dT
6. Vaccinia DNA topoisomerase l (VACC TOPO) – 3000 U/μL (Vivid Technologies). In the initial experiments we used 215 pmoles (7.1 μg) of the VACC TOPO per every 25 μL of the reaction mix. However, the topoisomerase concentration can be significantly reduced without the loss of sensitivity. We later used a four times lesser amount of VACC TOPO per section (1.76 μg in 25 μL of the reaction mix per section) with similar results. Reducing amount of the enzyme to 880 ng (in 25 μL of the reaction mix) resulted in a weaker signal and 8.8 ng of VACC TOPO produced no detectable signal.
7. T4 DNA ligase 5 U/μL (Roche). This highly concentrated ligase preparation gives the best signal in our experimental conditions.
8. 10 x reaction buffer for T4 DNA ligase: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl₂, 10 mM dithioerythritol, 10 mM ATP, pH 7.5 (20° C) (Roche) . ATP in reaction buffer is easily destroyed in repetitive cycles of thawing-freezing. Aliquot the buffer in small 15-20 μL portions and store at – 20° C. Use once.
9. 30% (w/v) solution of PEG-8000 (Sigma) in bidistilled water. 15 % PEG-8000 in the reaction mix strongly stimulates the detection, increasing the effective concentrations of its constituents by volume exclusion.
10. Proteinase K (Roche) 20 mg/mL stock solution in distilled water. Store at – 20° C. In the reaction use 50mg/mL solution in PBS, prepared from the stock. Do not reuse.
11. Vectashield with DAPI (Vector Laboratories).
12. Sodium bicarbonate buffer: 50mM NaHCO₃, 15mM NaCl, pH 8.2.
13. 22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section.