Summary

הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג' בתרבויות Slice Organotypic

Published: March 21, 2012
doi:

Summary

אנו מציגים פרוטוקול המאפשר להציג וכמותית לתחת המורפולוגיה של העץ הדנדריטי של תאים בודדים פורקינג' גדלו בתרבויות פרוסות cerebellar organotypic. פרוטוקול זה נועד לקדם מחקרים על המנגנונים של התפתחות הדנדריטים תא פורקינג'.

Abstract

תאי פורקינג' הם מערכת מודל אטרקטיבית ללימוד פיתוח הדנדריטים, כי יש להם עץ הדנדריטי מרשים שהוא בהחלט בכיוון במטוס sagittal ומתפתח בעיקר בתקופה שלאחר הלידה במכרסמים קטנים 3. יתר על כן, כמה נוגדנים זמינים אשר באופן סלקטיבי ואינטנסיביים תאי תווית פורקינג' כולל את כל התהליכים, עם D28K אנטי Calbindin להיות בשימוש הנרחב ביותר. לצפייה של הדנדריטים בתאי חיים, עכברים מבטאים EGFP סלקטיבי בתאי פורקינג' 11 זמינים דרך מעבדות ג'קסון. תאי תרבויות פרוסות cerebellar Organotypic לאפשר מניפולציה ניסויית קלה של התפתחות הדנדריטים תא פורקינג' כי רוב התרחבות הדנדריטים של העץ הדנדריטי תא פורקינג' אכן מתרחש בתקופת התרבות 4. אנו מציגים פרוטוקול קצר, אמין וקל לצפייה וניתוח המורפולוגיה של תאי דנדריטים פורקינג' גדלה בorganotypi כאןג תרבויות פרוסות מוח הקטנים. למטרות רבות, הערכה כמותית של העץ הדנדריטי תא פורקינג' רצויה. נתמקד להלן בשני פרמטרים, גודל עץ הדנדריטי ומספרי נקודות של סניף, שניתן לקבוע במהירות ובקלות מהתרבויות פרוסות אנטי calbindin המוכתמות cerebellar. שני פרמטרים אלו מניבים מדד אמין ורגיש של שינויים של העץ הדנדריטי תא פורקינג'. באמצעות הדוגמא של טיפולים עם החלבון קינאז C (PKC) activator PMA וקולט metabotropic גלוטמט 1 (mGluR1) אנחנו מדגימים כיצד הבדלים בהתפתחות הדנדריטים הם דמיינו וכמותית הוערכה. שילוב של הנוכחות של עץ הדנדריטים נרחב, שיטות immunostaining סלקטיבית ואינטנסיביות, תרבויות פרוסות organotypic שמכסות תקופה של צמיחת הדנדריטים ומודל עכבר עם ביטוי EGFP פורקינג' תא מסוים להפוך תאי פורקינג' מערכת מודל רבת עצמה עבור לחשוף את המנגנונים של הדנדריטים פיתוח.

Protocol

1. הגדרת תרבויות Slice cerebellar Organotypic תרבויות פרוסות cerebellar מוכנים מיום לידה 8 P (8) גורי עכברים בשיטת דגירת סטטי 10. במעבדה שלנו, אנו משתמשים B6CF1 עכברים. בניסויים מסוימים עכברים הטרנסגניים גם שמשו בי להביע EGFP סלקטיבי בתאי פורקינג'. ה?…

Discussion

השיטות שהוצגו כאן מאפשרים ללמוד פיתוח הדנדריטים תא פורקינג' בתרבויות פרוסות cerebellar organotypic וכדי להעריך כמותית הרחבת הדנדריטים תא פורקינג' על ידי מדידת גודל עץ הדנדריטי ומספר נקודתי הסתעפות הדנדריטים. כמובן, ניתוח כמוני מקיף ומתוחכם יותר של דנדריטים הסלולריים פור?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי האוניברסיטה של ​​באזל, המחלקה לביו, והשויצרית הקרן הלאומית למדע (31003A-116624).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Tissue culture Inserts Millipore PICM 03050 PICM ORG50 The PICMORG50 inserts have a low rim and allow viewing of live cultures at a microscope
MEM Gibco, Invitrogen 11012044
Glutamax 1 Gibco, Invitrogen 35050038
Basal Medum Eagle Gibco, Invitrogen 41010026
Horse serum Gibco, Invitrogen 26050070
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Tocris 1201
(RS)-3,5-Dihydroxy-phenylglycine (DHPG) Tocris 0342
Rabbit anti-calbindin D-28K Swant CB38
Anti NeuN, clone A60 Chemicon, Millipore MAB377
Rabbit anti-GFP Abcam Ab290

References

  1. Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells. Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).
  2. Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation. J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).
  3. Kapfhammer, J. P. Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells. Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).
  4. Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. Cerebellar slice cultures. Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).
  5. Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death. J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).
  6. Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-κB signaling. Neuron. 68, 45-60 (2010).
  7. Metzger, F., Kapfhammer, J. P. Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures. Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).
  8. Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice. Neuroscience. 110, 675-689 (2002).
  9. Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures. Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).
  10. Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  11. Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).
  12. Weyer, A., Schilling, K. Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum. J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).

Play Video

Cite This Article
Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (61), e3637, doi:10.3791/3637 (2012).

View Video