Summary

A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

Published: March 21, 2012
doi:

Summary

Apresenta-se um protocolo que permite visualizar e para avaliar quantitativamente a morfologia da árvore dendrítico das células de Purkinje individuais crescidas em culturas organotípicas do cerebelo. Este protocolo destina-se a promover estudos sobre os mecanismos de Purkinje desenvolvimento de células dendríticas.

Abstract

As células de Purkinje são um sistema de modelo atractivo para estudar o desenvolvimento dendrítico, porque têm uma árvore dendrítica impressionante, que é estritamente orientadas no plano sagital e desenvolve principalmente no período pós-natal, em pequenos roedores 3. Além disso, os anticorpos que estão disponíveis várias células de etiquetas selectiva e intensa de Purkinje, incluindo todos os processos, com anti-calbindina D28K sendo a mais amplamente utilizada. Para visualização dos dendritos em células vivas, os camundongos que expressam EGFP seletivamente nas células de Purkinje 11 estão disponíveis através Jackson laboratórios. Organotípicas culturas de células cerebelares fatia permitir a manipulação experimental fácil de Purkinje desenvolvimento de células dendríticas, porque a maior parte da expansão da árvore dendrítica de células dendríticas Purkinje realmente está ocorrendo durante o período de cultivo 4. Apresentamos aqui um protocolo curto, confiável e fácil de visualizar e analisar a morfologia dendrítica de células de Purkinje crescido em organotypic cerebelares culturas fatia. Para muitos fins, uma avaliação quantitativa da árvore dendrítica célula de Purkinje é desejável. Nós nos focamos em dois parâmetros, o tamanho da árvore dendrítica e números de ponto de desvio, que pode ser rápida e facilmente determinados a partir de anti-calbindina manchadas culturas fatia do cerebelo. Estes dois parâmetros produzir uma medida fiável e sensível de mudanças da árvore de Purkinje de células dendríticas. Utilizando o exemplo de tratamentos com a proteína-quinase C (PKC) e PMA activador do receptor de glutamato metabotrópicos 1 (mGluR1) é mostrado como as diferenças no desenvolvimento dendríticas são visualizadas e quantitativamente avaliados. A combinação de a presença de uma árvore dendrítica extensa, métodos selectivos e imunorreatividade intensa, as culturas organotípicas de fatias que cobrem o período de crescimento dendrítico e um modelo de rato com Purkinje expressão EGFP célula específica tornar as células de Purkinje de um sistema poderoso modelo para revelar os mecanismos de dendritic desenvolvimento.

Protocol

1. Criação de culturas organotípicas cerebelo Cultura de lâminas cerebelares são preparadas a partir de 8 dias pós-natal filhotes P (8) do rato utilizando o método de incubação estática 10. Em nosso laboratório, nós usamos B6CF1 ratos. Em algumas experiências ratinhos transgénicos também foram utilizadas as quais expressam EGFP selectivamente nas células de Purkinje. A preparação de culturas fatia demora cerca de 30 minutos por rato filhote, ou seja, 3 horas para u…

Discussion

Os métodos aqui apresentados permitem estudar Purkinje desenvolvimento de células dendríticas em culturas organotípicas do cerebelo e avaliar quantitativamente a expansão de células dendríticas Purkinje, medindo o tamanho da árvore dendrítica e o número de pontos de ramificação dendríticas. Naturalmente, uma análise mais completa e quantitativas sofisticadas de dendrites de células de Purkinje é possível, por exemplo, através da determinação comprimento dendrítico total, realizando uma análise de S…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pela Universidade de Basel, Departamento de Biomedicina, eo Swiss National Science Foundation (31003A-116624).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Tissue culture Inserts Millipore PICM 03050 PICM ORG50 The PICMORG50 inserts have a low rim and allow viewing of live cultures at a microscope
MEM Gibco, Invitrogen 11012044
Glutamax 1 Gibco, Invitrogen 35050038
Basal Medum Eagle Gibco, Invitrogen 41010026
Horse serum Gibco, Invitrogen 26050070
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Tocris 1201
(RS)-3,5-Dihydroxy-phenylglycine (DHPG) Tocris 0342
Rabbit anti-calbindin D-28K Swant CB38
Anti NeuN, clone A60 Chemicon, Millipore MAB377
Rabbit anti-GFP Abcam Ab290

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Cite This Article
Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (61), e3637, doi:10.3791/3637 (2012).

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