Summary
Elektrophysiologische Charakterisierung von neuronalen Antworten ist für das Verständnis der Gehirnfunktion und für das Führen der Anordnung von Farbstoffen für die Ablaufverfolgung Weg wichtig. Allerdings sind viele Studien an narkotisierten Tieren durchgeführt. Um die Hirnfunktion ohne Betäubung zu verstehen, entwickelten wir eine Methode, um neuronale Antwort Eigenschaften zu erfassen und zu injizieren Farbstoffe in wach-Maus.
Abstract
Es ist bekannt, dass die Narkose Nervenreaktion Eigenschaften verändert in verschiedenen Regionen des Gehirns. 13. Im auditorischen System werden grundlegende Eigenschaften der Reaktion Neuronen des Hirnstamms einschließlich Schwelle, Frequenz Spezifität und inhibitorischen Seitenbänder in signifikanter Weise unter Narkose 2.1 verändert. Diese Beobachtungen veranlassten Physiologen an Möglichkeiten, von einzelnen Neuronen, ohne dass die Kontamination Auswirkungen der Narkose aufnehmen zu suchen. Ein Ergebnis war ein decerebrate Herstellung, wobei der Hirnstamm vollständig auf der Ebene der Mittelhirn 4 wurde durchtrennt. Die Nachteile dieser Vorbereitung sind eine gewaltige Operation, die Beseitigung der absteigenden Projektionen aus dem Vorderhirn, und die Unfähigkeit, sensorische Stimulation zu verwenden, um Strukturen oberhalb des Mittelhirns zu untersuchen. Eine andere Strategie bestand darin, Elektroden-Arrays chronisch implantieren, um aus einzelnen Neuronen und Mehrfach-Cluster aufnehmen, während das Tier wach ist und / oder verhalten 5,6 09.07 bis 12.10 Maus verwendet werden, angepasst. Mit dieser Methode können wir elektrophysiologische Ableitungen über mehrere Tage in der nicht narkotisierten Maus befragen. Am Ende der Aufnahme-Sessions, können wir dann einen Farbstoff zu injizieren Elektrodenpositionen und Aufzeichnung Seiten zu rekonstruieren oder ein Tracer injiziert, so dass Wege von und zu den Aufnahme-Loci bestimmt werden kann. Diese Methode erlaubt es gut isoliert einzelnes Neuron Aufnahmen über mehrere Tage ohne den Einsatz Anästhetika.
Protocol
1. Kopfstützenantrieb Überblick
- Um einen speziell angefertigten Kopf-post montieren, legen Sie eine 1/16 "Edelstahl-Roll-Stift senkrecht in einem Loch in einer 3/32 gebohrt" Stab aus rostfreiem Stahl, um ein Kreuz bilden. Die vertikale Teil des Kopf-Beitrag sollte etwa 20 mm und die horizontale Quersteg etwa 15 mm betragen. Tippen einem Ende der vertikalen Stange, um eine # 1-72 Schraube. (Abb. 1).
- Während der Operation und der Aufnahme wird die Kopf-Beitrag in einer speziell angefertigten Messing oder Aluminium Montage Bar mit # 1-72 Schraube (Abb. 2) gesichert. Das lange Stück der Montageschiene sollte etwa 90 mm lang und 5-10 mm breit. Der Kopf-Beitrag passt in einer Nut in eine 15 mm breite von der langen Stange, die bei 45 ° abgewinkelt ist. Um Drehung des Kopfes, der Steg der Kopf-Beitrag eingebettet in einer kleinen Rille auf der Unterseite des Befestigungsstabes verhindern.
- Der Befestigungsstab in dann in eine maßgeschneiderte Aluminium-Halterung befestigt block (Abb. 3). Der Befestigungsblock von etwa 30 mm x 30 mm x 25 mm. Diese Montageblock mit einem Mikromanipulator angebracht, so dass die Position des Kopfes-Beitrag genau entlang der Mittellinie und Bregma abgegeben werden. Der Befestigungsblock aus zwei Teilen mit Schrauben befestigt hat. Ein Ausschnitt in dem Block ermöglicht die Montage bar zu rutschen in und mit den Schrauben befestigt werden. Der Befestigungsstab parallel zu der Tischoberfläche. Während der Aufnahme sichern die Bar in einem benutzerdefinierten stereotaktischen Rahmen (Abb. 4). Die stereotax ausgebildet ist, um die Stange in der gleichen Position wie in dem Befestigungsblock während der Operation zu montieren. Diese Anordnung gewährleistet, dass die Maus immer wird dem stereotaktischen Rahmen in experimentellen Sitzungen ausgerichtet werden.
- Schneiden Sie ein Wolfram-Stab (Durchmesser 0,010 ") bis ca. 5 mm Länge, mit ca. 1 mm bei 45 ° gebogen. Dieser Stab dient als Masse-Pin (Abb. 1).
2. Stereotaktische Alignment für Kraniotomie
Hinweis: Alle nachstehend beschriebenen Verfahren folgen der üblichen aseptischen chirurgischen Techniken und wurden von der Washington State University Animal Care und Use Committee und der Animal Ethikkommission der Garvan Institut genehmigt worden.
- Anesthetize der Maus, indem in einer Ansaugkammer mit 5% Isofluran. Das Fehlen einer Reaktion auf Schwanz und / oder Zehen Pinch stellt sicher, dass das Tier betäubt vollständig ist.
- Platzieren Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen Nagetier mit einem Maus-Adapter (Stölting) ausgestattet. Zur Ausrichtung der Maus richtig, legen Sie die Zähne in das Loch des Bisses Bar und ziehen Sie die Nase Klemme, sodass es eng wird. Platzieren Sie die Maus so gerade wie möglich in der Beißwulst und Nase Klemme. Platzieren Sie eine Maske aus einem Stück Latex-Handschuh über der Maus die Nase gemacht, und halten Sie die Isofluran bei 5% bis die Maus die Atemfrequenz liegt bei ca. 1 Atemzug / sec. Drehen Sie das Isofluran auf 1,5 bis 2,0%. Sichern Sie den Kopf mit tEr Ohr-Bars dabei darauf achten, nicht durchlöchern das Trommelfell. Bars müssen eng anliegen, aber nicht zu tiefes Eindringen in die Gehörgänge.
- Setzen Sie ein Heizkissen der Unterseite der Maus.
- Bewerben Augensalbe, um die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern.
- Rasieren Sie die Kopfhaut aus zwischen den Ohren bis zu den Augen mit einem kleinen Rasierapparat oder feinen Schere-Punkt.
- Reinigen und desinfizieren Sie die Kopfhaut durch Abwischen mit Chlorhexidin (oder Betadin) Peeling durch Alkohol abspülen 3 mal wiederholt.
- Um die Haut über der Oberseite des Schädels entfernt einen Einschnitt entlang der Mittellinie von der Rückseite des Kopfes auf die Augen.
- Kratzen Sie die Knochenhaut zu den Kanten des Einschnitts mit dem Skalpell. Bei Bedarf (je nach experimentellen Ziel), vorsichtig einfahren, die Muskulatur an der Rückseite des Halses mit einer Pinzette, wodurch die Muskeln entlang Faszikel reißen, um Blutungen zu minimieren. Bewerben Gelschaum unter Kopfhaut Gewebe, um Feuchtigkeit zu minimieren und zu verhindern, die Haut vor dem Überfahren des Schädels.
- Trocknen Sie die Oberfläche mit einem Schädel Wattestäbchen mit Isopropylalkohol befeuchtet, um die Visualisierung von Landmarken Schädel zu verbessern.
- Richten Sie den Schädel, um Standard-stereotaktischen Koordinaten 13. Legen Sie eine feine-Punkt-Sonde in den Elektrodenhalter und befestigen Sie es am stereotaktischen Mikromanipulator. Eine geschärfte Metallstab eignet sich gut für diesen Zweck (Abb. 5).
- Verwenden Sie den Punkt zu Bregma (5A) und Lambda (5B) auf dem Schädel zu identifizieren. Bewegen Sie die Sonde zurück und Her zwischen diesen Punkten, die Überprüfung, dass die lateral-medial-Koordinate für jeden Ort um nicht mehr als 50 um unterscheidet. Positionieren Sie den Kopf, als durch vorsichtiges Lösen der Ohr-Bars, Verschieben des Kopfes und Ohres-Bars seitlich und Nachziehen der Ohr-Bars benötigt.
- Überprüfen, ob der dorso-ventralen Höhe an jeder Stelle um nicht mehr als 50 um unterscheidet. Stellen Sie die Höhe der Nase-Clamp wird, welche den Schädel um die Achse der Ohr-Bars zu drehen,, um die Tonhöhe des Schädels, wenn notwendig, zu nivellieren. Die Höhe des Ohr-Bar könnte auch angepasst werden müssen.
- Verwendung eines Atlas 13, um die Koordinaten des Zieles von Interesse (5C) relativ zu Bregma identifizieren. Markieren Sie den Schädel über dem Ziel (zB ein "X" oder verwenden Tusche auf Punkt vier Ecken eines Quadrats), wo eine Kraniotomie gemacht wird (5D) werden.
3. Head-Post und Ground Pin-Installation
- Verwenden Sie Etch Gel auf Schädel zu reinigen. Verwenden Sie den Applikator zu schrubben und zu verbreiten Etch Gel über die Oberfläche (10 Sek.). Mit Wasser abwaschen und vollständig trocknen. Die Grundierung für Zahnzement an der Kopfoberfläche mittels Applikator. Kleberbett mit neuen Applikator. Den Klebstoff mit einem UV-Licht-gun (1 Zyklus).
- Wählen Sie einen Speicherort für die Erdung, die distal der Ziel-Site ist. Vorsichtig trug ein kleines Loch in den Schädel mit der Spitze eines # 65 Miniblade Skalpell gerade breit genug für das kurze Ende der Erde S.zu betreten und in Ruhe auf den Hirnhäuten. Der Erdungsstift sollte so ausgerichtet sein, dass es verweist weg von Bregma und die Zukunft Kopf-Beitrag (6A).
- Sichern Sie die Kopf-Beitrag an die Montageschiene und zu blockieren und heften sich an dem Mikromanipulator. Durch Bewegen der Mikromanipulator in drei Dimensionen, positionieren Sie den Kopf-Beitrag über Bregma, gerade berührt den Schädel (Abb. 6B). Die Basis des Kopf-Beitrag sollte liegen auf dem Schädel flach.
- Mit Dissektion Sonden, eine kleine Menge von Zahnzement um den Kopf-post-und Masse-Pin (6C). Drücken Sie die Zement nach unten um einen guten Kontakt mit dem Schädel zu gewährleisten. Hinweis: Verwenden Sie nicht zu viel Zement oder es wird nicht gleichmäßig hart werden. Cure den Zement mit einem UV-Licht-gun (3-4 Zyklen aus verschiedenen Blickwinkeln).
- Tragen Sie die zweite Stufe der Zement-und Aufbau der Basis um den Kopf-post-und bedecken Sie die Rillen des Kopf-Beitrag (6D).
4. Kraniotomie
- Suchen Sie nach der Kraniotomie Referenzmarke, die teilweise durch den Primer wird verdeckt werden. Verwenden Sie ein Skalpell Nr. 65 zu einem 3 mm x 3 mm zu kennzeichnen Platz um diese Stelle herum und einen Tropfen Lidocain, um die Empfindlichkeit zu reduzieren und die Blutungen zu minimieren.
- Machen Sie mehrere Noten auf jeder Seite des Platzes (so viele wie 10), man aufpassen, nicht durch den Knochen und in das Gehirn geschnitten (Abb. 7A).
- Sobald der Knochendeckel wird locker mit der Spitze des Skalpells, um es zu hebeln und hinterlässt die Dura mater intakt (Abb. 7B).
- Deckel mit Knochenwachs.
5. Post-Chirurgie
- Schalten Sie Gas Anästhesie und entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen.
- Verwenden Sie ein Wattestäbchen zu Lidocain Salbe um ausgesetzte Haut gelten für Aufsehen rund um Wunde betäuben. Verwenden Sie ein weiteres Wattestäbchen anwenden Neosporin auf die unbedeckte Haut. Inject Ketoprofen (5 mg / kg IM oder IP auf Bevorzugung einzelner IACUC Tierärzte basierend) alsein Post-Operation Schmerzmittel. Maus wird im allgemeinen nach oben und bewegt nur wenige Minuten von Gas Aufhören.
- Bewegen Sie die Maus an einem warmen Käfig und Monitor, bis es bereit ist, für Tierhaltungen zurückzukehren.
- Das Tier sollte auf mindestens einmal geprüft werden pro Tag, nachdem sie von der Operation erholt hat. Achten Sie auf Anzeichen von schlechter Ernährung und / oder Trink-und lustlos Verhalten. Sollten die Schmerzen vermutet wird, bieten Ketoprofen alle 24 Stunden (gleiche Dosis wie am Ende der postoperativen) bis gemildert. Lidocain kann lokal auf die Wunde, wenn das Tier kratzt angewendet werden oder zeigt Anzeichen von Unwohlsein. Tiere in der Regel von der Operation ohne Komplikationen oder Schmerzen zu erholen.
6. Aufnahme-und Dye Injection
- Warten Sie mindestens einen Tag nach der Haupt-post-Chirurgie, bevor Sie die Maus für die Aufnahmen.
- Bewegen Sie die Maus in einem Schaum-Haltevorrichtung auf die Maus den Körper geformt. Die Maus hat bereits an diesem Gerät angepasst worden, wodurch seine Angst. Typische Anpassung istum die Maus zu verarbeiten jeden Tag nach dem Absetzen und für etwa eine Woche vor der Operation und Experimente, platzieren Sie die Maus in die Schaum-Gerät für 1-5 Minuten. Suspend-Gerät in der stereotaktischen Rahmen (Abb. 4).
- Sichere Kopf-Beitrag zu Einbau-Bar, die nun auf den stereotaktischen Rahmen (Abb. 4) befestigt ist.
- Verbinden Sie mit dem Erdungsstift mit einem Draht mit einem stumpfen 22-Gauge-Injektionsnadel Spitze abgebrochen.
- Entfernen Sie Knochenwachs über die Kraniotomie. Entfernen Sie ggf. Dura mit der Spitze eines Miniblade Skalpell.
- Ansteuerelektrode, um eine ordnungsgemäße stereotaktischen Ort und starten Sie die Aufnahme (Abb. 8). Für nur elektrophysiologischen Ableitungen, kann eine Vielzahl von Elektroden verwendet werden. Die Wahl der Elektrode ist abhängig von der Lage und Art der Aufnahmen erforderlich. Die Wahl der Elektrode für die wach-Maus-Aufnahmen wird das gleiche wie das, was ein Forscher nutzt in einer narkotisierten Maus sein. Bei kombinierten elektrophysiologischen Ableitungen mitFarbstoff / Tracer Injektionen, wird eine Mikropipette Elektrode 10 verwendet. Die Pipette wird mit dem Farbstoff / Tracer der Wahl, so dass es iontophoretisch kann am Ende der elektrophysiologischen Experimenten injiziert werden gefüllt. Mehrgehäusigen Elektroden können auch verwendet werden, so dass die pharmakologische Manipulationen vorgenommen werden können. Die mehrgehäusigen Elektrode auf einer einzigen Aufnahme Mikropipette (8) angebracht ist. Diese Techniken sind Standard in der Literatur und unterscheiden sich nicht für narkotisierten gegen wach-Aufnahmen.
- Die Aufnahmen können für 4-5 Stunden über 3-4 aufeinander folgenden Tagen durchgeführt werden.
- Am Ende der Aufzeichnung, kann der Farbstoff / Tracer werden. Da es keine Schmerzen Rezeptoren im Gehirn sind, ist die iontophoretische mit dem Farbstoff oder Tracer in das Gehirn wahrscheinlich Unbehagen zu verursachen. Sobald jedoch die elektrophysiologische Reaktion Eigenschaften des Bereichs, wo die Injektion vorgenommen werden soll dadurch gekennzeichnet sind, kann das Tier mit Isofluran foder die Injektion. Dadurch würden die mögliche unerwünschte Empfindungen. Da der Farbstoff / Tracer ist bereits in der Mikropipette, können die aktiven und Masseleitungen der elektrophysiologischen Aufnahme eingeschaltet sein Aufbau an den Stromgenerator zur iontophoretischen injizieren Farbstoff / Tracer. Verwenden Sie geeignete Protokoll für die Farbstoff / Tracer in der Elektrode. Entfernen Sie das Tier aus der headpost Zurückhaltung und Körper Zurückhaltung und Rückkehr zu seinen eigenen Käfig.
- Am Ende des Experiments, folgen entsprechende Protokoll für Euthanasie und Tissue verarbeitende an der Injektionsstelle und Kennzeichnung zu erholen.
7. Repräsentative Ergebnisse
Erfolgreiche Installation des Kopf-Beitrag kann der Experimentator zu Einzel-und Mehrfach-Antworten von einem nicht narkotisierten, wach Maus aufzeichnen über mehrere Tage. Das Rückhaltesystem ermöglicht einen stabilen elektrophysiologischen Ableitungen einzelner Nervenzellen im Gehirn. Hervorragende Isolierung einzelner Einheiten und starke Reaktionen to Stimuli können aus dem gleichen Gehirnstruktur über mehrere Tage aufgezeichnet werden, zum Beispiel bei der Maus Colliculus inferior (9A, Tag, 9B, zweiten Tag). Mit einem guten Kopf-post-Installation wird jede Maus konsequent an den stereotaktischen Apparat und der Maus stereotaktischen Atlas, 13 führen zu zuverlässigen Lokalisierung von bestimmten Hirn-Kerne ausgerichtet werden. Dies ermöglicht zuverlässige Lokalisierung für die Injektion von Farbstoffen und Tracer in spezifischen Strukturen nach dem Multiple Recording Tage. Zum Beispiel, zu beurteilen, absteigend Projektionen aus dem auditorischen Mittelhirn der auditorischen Hirnstamm, biotinylierte Dextran Amin (visualisiert mit Diaminobenzidin als Chromogen) können in der Maus Colliculus inferior (Abb. 10A) nach elektrophysiologisch Identifizierung neuronale Antwort Eigenschaften an der Injektionsstelle injiziert werden (in Fig.. 10A ist ein Neuron mit einer besten Frequenz von 51 kHz aufgenommen), und nach Gewebebearbeitung, einnterograde Kennzeichnung in der kontralateralen dorsalen Nucleus cochlearis kann visualisiert und aufgezeichnet wurde (Abb. 10B). Mikrophotographien einer höheren Auflösung kann auch erhalten werden, um anterograd markierten Axone und Anschlüsse (10C) ansehen zu können.
Abbildung 1.
Abbildung 2.
Abbildung 3.
Abbildung 4.
Abbildung 5.
Abbildung 7. 
8. 
Abbildung 9. 
Abbildung 10.
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Discussion
Der Vorteil des Kopf-post-Rückhaltesystem für elektrophysiologische und neuroanatomische Experimente in der Maus ist, dass Experimente mit nicht narkotisierten, wach Mäusen durchgeführt werden kann, sodass potenzielle Reaktion Kontamination durch Anästhetika. Darüber hinaus kann der Aufbau über mehrere Tage verwendet werden, um eine effizientere Nutzung von Tieren zu ermöglichen.
Die meisten Komponenten für den Kopf-Beitrag zur Verfügung off-the-shelf. Nur der Kopf-post-und Vorrichtung zur Befestigung sind maßgeschneiderte, welche beide relativ einfach zu konstruieren sind und sind wiederverwendbar. Wenn eine Maschine Geschäft ist nicht in einer Einrichtung verfügbar ist, kann der Forscher wahrscheinlich verwenden http://www.emachineshop.com/ , um die erforderlichen Komponenten zu fertigen.
Kompetente chirurgischen Fertigkeiten notwendig sind. Der Chirurg muss mit feinen chirurgischen Techniken, von denen einige besten unter einem Mikroskop durchgeführt beherrschen. Die Operation muss unter aseptischen Bedingungen erfolgen. Ausbauen des Schädels Klappe ist der heikelste Punkt des Verfahrens. Durch die sorgfältige und sanft macht mehrere Noten mit einem Skalpell entlang der vier Seiten des Rechtecks, während Sie durch ein Operationsmikroskop, kann der Schädel Klappe "tauchte ab" werden mit minimalen Blutungen, so dass die Dura mater intakt. Die Vertrautheit mit dem zugrunde liegenden Gefäßsystem ist wesentlich, da damit ein Schnitt über ein wichtiges Blutgefäß ein Risiko unerwünschter Blutungen schafft. Da unsere Forschung konzentriert sich auf das auditorische System haben wir die Verwendung von Bohrern für die Durchführung Kraniotomien, um das Potenzial für Knochen durchgeführt Innenohr Trauma zu minimieren vermieden.
Es ist wichtig, um die Vorwärts-Rückwärts-Ebene als auch in stereotaktischen Ausrichtung vor dem Anbringen der Kopf-Beitrag zu erhalten. Diese Vorsichtsmaßnahme stellt sicher, dass der Kopf wird in experimentellen Studien Niveau bleiben und erleichtert die Lage des Gehirns Loci mit einem Gehirn-Atlas.
Zelt "> Für die Aufnahme, ist es sinnvoll, die Maus auf einer täglichen Basis für ein paar Tage vor der Operation zu behandeln. Allein schon die Maus ausgesetzt Handhabung und Zurückhaltung in der Schaum-Gerät ermöglicht längere Aufnahme-Sessions mit viel Stress reduziert und die Bewegung des Maus. Der Schlüssel ist, haben sich die Maus gut in der Schaum-Sandwich. Wenn das Tier übermäßig bewegen können, sie ständig zu kämpfen neigt. Wenn die Maus beginnt zu kämpfen, ist es am besten, um die Aufnahme-Session zu beenden und wieder anziehen beim nächsten Tag. Bewegung der Maus führt zu großen Biopotentialen in den Aufnahmen, die nicht durch die Reize hervorgerufen werden. Dies sind im Allgemeinen größere Amplitude als Aktionspotentialen und intermittierend sind. Bewegungsartefakte kann auch durch die Aufnahme Drähte berühren das Tier erzeugt werden. Es ist wichtig um sicherzustellen, dass keine Drähte das Tier zu berühren. Insgesamt hat sich diese Technik erlaubt es uns, mehrere Studien zur auditiven Verarbeitung und Anatomie durchzuführen ohne den Einsatz von Anästhetika.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Unterstützt durch NSF 0920060, NIH DC004395, NHMRC Zuschuss 1009482, NSW Office of Science and Medical Research, und dem Passe Garnett und Rodney Williams Memorial Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Etch gel for cleaning skull prior to dental cement | Henry Schein | 101-5396 | 12/pk with 1.2 mL syringes |
| Primer for dental cement | Kerr Optibond | 25881 | 8 mL bottle |
| Adhesive for dental cement | Kerr Optibond | 25882 | 8 mL bottle |
| Applicators for dental cement | Kerr Optibond | 24680 | 200/pk |
| Dental Cement | Charisma, Heraeus Kulzer | 66000085 | 4gm Syringe Refill |
| Tungsten Rod (Ground Pin) | A-M Systems | 717200 | 0.010" diameter |
| Economy UV Curing Light | Henry Schein | CU-80 | |
| Head-post | Built in-house | ||
| Mounting bar | Built in-house | ||
| Mounting block | Built in-house | ||
| Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | 902 | |
| Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting Co. | 51625 | |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific, Inc. | 39DP |
References
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