Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) for Højkapacitetsforskning Antifungisk Drug Screening
Summary
Vi har udviklet et high-density microarray platform bestående af 3D nano-biofilm i<em> C. albicans</em> Kaldet<em> Ca</em> BChip. Modtagelighed profil af lægemidler testet på en<em> Ca</em> BChip er sammenlignelig med konventionelle 96-brønds plade model antyder, at fungale chippen er ideelt egnet til sand high-throughput screening af antifungale midler.
Abstract
Candida albicans er stadig den vigtigste ætiologiske agent for candidiasis, som i øjeblikket udgør den fjerde mest almindelige nosokomiel infektion i blodet i amerikanske hospitaler 1. Disse opportunistiske infektioner udgør en voksende trussel for et stigende antal af inficerede individer, og bære uacceptabelt høj dødelighed. Dette er til dels skyldes den begrænsede arsenal af antifungale stoffer, men også til udvikling af resistens over for de mest almindeligt anvendte antifungale midler. Yderligere komplicerer behandling er, at et flertal af manifestationer af candidiasis er forbundet med dannelsen af biofilm, og cellerne i disse biofilm viser forhøjede niveauer af resistens over for de fleste klinisk anvendte antisvampemidler 2. Her beskriver vi udviklingen af en høj densitet mikroarray, der består af C. albicans nano-biofilm, som vi har kaldt Ca BChip 3. Kort fortalt er en robot microarrayer anvendes to trykte gærceller af C. albicans på et fast substrat. Under trykning, er gærceller indesluttet i en tredimensional matrix under anvendelse af en volumen så lav som 50 nL og immobiliseres på et glassubstrat med en egnet coating. Efter indledende trykning er lysbilleder inkuberes ved 37 ° C i 24 timer for at tillade biofilm udvikling. I denne periode spots vokse ind i fuldt udviklede "nano-biofilm", som skal vises typiske strukturelle og fænotypiske karakteristika, der er forbundet med modne C. albicans biofilm (dvs. morfologisk kompleksitet, tredimensionelle arkitektur og medicinresistens) 4. Samlet set er Ca BChip sammensat på ~ 750 tilsvarende og rumligt tydelig biofilm, med den yderligere fordel, at flere chips kan udskrives og behandles samtidigt. Cellelevedygtighed vurderes ved at måle fluorescensintensiteten af FUN1 metabolisk farvning under anvendelse af en mikroarray scanner. Denne svamp chip er ideelt egnet til use i ægte high-throughput screening for antifungal lægemiddelopdagelse. Sammenlignet med de nuværende normer (dvs. 96-brønds mikrotiterplade model af biofilmdannelse 5), de vigtigste fordele ved den fungale biofilmen chip er automatisering, miniaturisering, besparelser i mængden af og prisen på reagenser og analyser tid, samt fjernelse af arbejdskraft intensive trin. Vi mener, at en sådan chip i væsentlig grad vil fremskynde svampedræbende drug discovery processen.
Protocol
Discussion
Vi har udviklet en cellebaseret høj densitet mikroarray, Ca BChip bestående af nanoliter volumener Candida albicans biofilm. Mikroarrayet blev trykt på modificeret glassubstrater, der tillades for en robust fastgørelse af collagen gel pletter samtidig med hydrofobicitet er nødvendig for en ikke-spredning, halvkugleformet 3D gel. En enkelt Ca BChip kan erstatte cirka otte plader med 96 brønde, og flere chips kan udskrives og behandles på samme tid. Chippen anvender nano-skala kulturer, g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret delvist af tilskud fra det sydlige Texas Technology Management (POCrr 2009,041), Institut for Integration of Medicine og videnskab fra National Center for Research Resources (UL 1RR025767), og fra National Institute of Dental & kraniofaciale Research ( 5R21DE017294).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | |
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
References
- Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
- Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
- Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
- Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
- Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).
