Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) voor high-throughput antimycoticum Screening
Summary
We hebben een hoge dichtheid microarray platform bestaande uit 3D nano-biofilms van<em> C. albicans</em> Genoemd<em> Ca</em> BChip. De gevoeligheid profiel van geneesmiddelen getest op<em> Ca</em> BChip is vergelijkbaar met de conventionele 96-well plaat model, wat suggereert dat de schimmel chip bij uitstek geschikt voor echte high-throughput screening van antimycotica.
Abstract
Candida albicans blijft de belangrijkste etiologische agent van candidiasis, dat momenteel de vierde meest voorkomende nosocomiale infectie bloedstroom in Amerikaanse ziekenhuizen 1. Deze opportunistische infecties toenemende mate een bedreiging voor een toenemend aantal van gecompromitteerde individuen, en dragen onaanvaardbaar hoge sterftecijfers. Dit is gedeeltelijk door de beperkte arsenaal van antimycotica, maar ook de resistentie tegen de meest toegepaste antischimmelmiddelen. Verdere complicatie behandeling is het feit dat de meeste manifestaties van candidiasis geassocieerd met de vorming van biofilms en cellen in deze biofilm tonen verhoogde weerstand tegen klinisch meest gebruikte antischimmelmiddelen 2. Hier wordt de ontwikkeling van een hoge dichtheid microarray die bestaat uit C. albicans nano-biofilms, die we hebben genoemd Ca BChip 3. In het kort wordt een robot microarrayer gebruikt to druk gistcellen van C. albicans op een vast substraat. Tijdens het drukken worden de gistcellen ingesloten in een driedimensionale matrix, waarbij het volume zo laag als 50 NL en geïmmobiliseerd op een glazen substraat met een geschikte coating. Na de eerste drukken worden de dia geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 24 uur om voor biofilm ontwikkeling. Gedurende deze periode de vlekken uit te groeien tot volledig ontwikkelde "nano-biofilms 'die worden weergegeven typische structurele en fenotypische kenmerken die geassocieerd worden met oude C. albicans biofilms (dwz morfologische complexiteit, driedimensionale architectuur en de resistentie tegen geneesmiddelen) 4. In het algemeen wordt de Ca BChip uit ~ 750-equivalent en ruimtelijk gescheiden biofilm, met het bijkomende voordeel dat meerdere chips kunnen worden gedrukt en gelijktijdig verwerkt. Levensvatbaarheid van de cellen wordt geschat door het meten van de fluorescentie-intensiteit van FUNC1 metabole vlek met behulp van een microarray scanner. Deze schimmel chip is uitermate geschikt voor use in echte high-throughput screening voor antischimmel drug discovery. In vergelijking met de huidige normen (dat wil zeggen de 96-wells microtiterplaat model van biofilmvorming 5), de belangrijkste voordelen van de schimmel biofilm chip zijn automatisering, miniaturisatie, besparingen in hoeveelheid en kosten van de reagentia en analyse tijd, evenals de afschaffing van de arbeid intensieve stappen. Wij zijn van mening dat een dergelijke chip aanzienlijk zal versnellen van de antifungale drug discovery proces.
Protocol
Discussion
We hebben een cel op basis van high-density microarray, Ca BChip, bestaande uit nanoliter volumes van Candida albicans biofilms. De microarray werd gedrukt op gemodificeerde glazen substraten, waardoor voor robuuste bevestiging van collageen gel spots terwijl hydrofobiciteit nodig voor een niet-spreiden, halfronde 3D gel. Een Ca BChip kan vervangen ongeveer acht 96 putjes, en verschillende chips kunnen worden gedrukt en verwerkt tegelijkertijd. De chip maakt gebruik van nano-schaal culturen, m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd deels gefinancierd door subsidies van de Zuid-Texas Technologie Management (POCrr 2009,041), het Instituut voor Integratie of Medicine en Science van de National Center for Research Resources (UL 1RR025767), en van het National Institute of Dental & Craniofaciale Onderzoek ( 5R21DE017294).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | |
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
References
- Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
- Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
- Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
- Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
- Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).
