Summary
Nous avons développé une plate-forme puces à ADN de haute densité composé de nano-3D des biofilms
Abstract
Candida albicans reste le principal agent étiologique de la candidose, qui représente actuellement le quatrième plus fréquente des infections nosocomiales circulation sanguine dans les hôpitaux américains 1. Ces infections opportunistes constituent une menace croissante pour un nombre croissant de personnes immunodéprimées, et porter les taux de mortalité anormalement élevé. Ceci est en partie due à l'arsenal limité de médicaments antifongiques, mais aussi à l'émergence de la résistance contre les agents antifongiques les plus couramment utilisés. Pour compliquer encore le traitement est le fait que la majorité des manifestations de la candidose sont associés à la formation de biofilms, et les cellules au sein de ces biofilms montrent des niveaux accrus de résistance à la plupart cliniquement agents antifongiques utilisés 2. Nous décrivons ici le développement d'une puce à ADN de haute densité qui se compose de C. albicans nano-biofilms, que nous avons nommé Ca BChip 3. En bref, un microarrayer robotique est utilisée tcellules de levure o impression de C. albicans sur un substrat solide. Pendant l'impression, les cellules de levure sont enfermés dans une matrice tridimensionnelle en utilisant un volume aussi faible que 50 nL et immobilisée sur un substrat en verre avec un revêtement approprié. Après l'impression initiale, les lames sont incubées à 37 ° C pendant 24 heures pour permettre le développement du biofilm. Au cours de cette période, les taches se transformer en plein développement "nano-biofilms» qui présentent certains éléments typiques des caractéristiques structurelles et phénotypiques liées à maturité C. albicans biofilms (c.-à-la complexité morphologique, architecture à trois dimensions et la résistance aux médicaments) 4. Dans l'ensemble, le BChip Ca se compose de ~ 750 équivalents biofilms et spatialement distinctes, avec l'avantage supplémentaire que plusieurs puces peuvent être imprimées et traitées simultanément. La viabilité cellulaire est estimée par la mesure de l'intensité de fluorescence de MIN1 métabolique tache en utilisant un scanner puces à ADN. Cette puce fongique est idéal pour usoi dans le vrai criblage à haut débit pour la découverte de médicaments antifongiques. Par rapport aux normes actuelles (c.-à-le modèle de 96 puits de plaques de microtitration de la formation de biofilm 5), les principaux avantages de la puce biofilm fongique sont l'automatisation, la miniaturisation, les économies en montant et le coût des réactifs et des analyses en temps, ainsi que l'élimination du travail étapes intensives. Nous croyons que la puce tels permettra d'accélérer considérablement le processus de découverte de médicaments antifongiques.
Protocol
1. Préparation des lames fonctionnalisées
- Placez les lamelles de microscope dans un tiroir amovible, et laver deux fois en l'immergeant dans une cuvette contenant de l'éthanol 99% (grade histologique). Essuyez les diapositives nettoyer en utilisant des serviettes en papier (en veillant à ne pas générer de la poussière de papier), et à sec en utilisant un jet d'azote gazeux comprimé.
NOTE: Ne pas utiliser Kim-Wipes pour essuyer les lames comme il générer de la poussière de papier fin.
- Immergez la grille coulissante contenant les lames dans une cuve de coloration rempli d'acide sulfurique concentré et incuber à température ambiante pendant une nuit.
REMARQUE: Pour éviter le contact avec la peau, utilisez des gants résistant aux produits chimiques et des lunettes de sécurité tout en travaillant avec des acides concentrés et les produits chimiques toxiques et corrosives.
- Soniquer les diapositives pendant 30 min et lavage avec Milli-Q (18 MQ) de l'eau pendant 30 min, suivi avec un autre de lavage dans uncétone pendant 5 min. Ce traitement expose les groupes silanol sur la surface du verre.
- Enduire les lames propres avec 2,5% (vol / vol dans l'eau) de 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES) solution, par immersion de la grille dans APTES pendant 30 min, laver 3 fois en eau Milli-Q pendant 15 min à chaque lavage, et la cuisson les diapositives dans un four à 110 ° C pendant 15 min. Cuisson permet de réticulation des APTES, résultant en-NH 2-fonctionnalisation de la surface.
REMARQUE: Assurez la solution APTES dans un récipient en plastique puisque les dépôts APTES préférentiellement sur les murs de récipient en verre.
- Utilisation d'un tournette, enrober les lames avec 1% (poids / volume dans le toluène) en polystyrène-co-anhydride maléique (MA-PS) (Sigma) pour réaliser une mono-couche de revêtement hydrophobe 6. Ajouter 2,0 mL de PS-MA sur une lame de verre propre monté sur une tournette et le manteau à 3000 rpm pendant 30 s. Ces conditions peuvent varier en fonction de paramètres de revêtement de spin tels que le revêtement afinlution, substrat, l'épaisseur de revêtement et régie par l'équation suivante 7
où h est l'épaisseur de film de revêtement, e est le taux d'évaporation, η, ρ C et la viscosité, la concentration et la densité de la solution de revêtement, respectivement, et ω est la vitesse angulaire.
REMARQUE: Le toluène est nocif lorsqu'il est inhalé pendant une longue période et de l'utilisation d'une hotte aspirante est recommandé.
- Les diapositives peuvent être stockés dans un tiroir pendant un mois dans un endroit sec, sans poussière conditions à 2 - 8 ° C.
2. Préparation des inoculums de levure et d'encapsulation de collagène
- Préparer une culture de nuit de C. albicans souche SC5314, dans levure-peptone-dextrose [YPD; 10 g / L d'extrait de levure, 20 g / L de peptone et 20 g / L de dextrose] milieu liquide par inoculation d'une colonie unique de C. albicans dans 10 à 20 mL de YPD 8. Incuber la culture dans un agitateur orbital (environ 150 - 200 rpm) à 30 ° C pendant la nuit. Récolte 1 mL levure Candida albicans cellules de nuit cultures YPD (par centrifugation à 5000 rpm pendant 5-10 minutes) et laver deux fois pendant 10 min dans 1 ml de phosphate stérile (PBS, 10 mM de tampon phosphate, 2,7 mM de chlorure de potassium, 137 mM de chlorure de sodium, pH 7,4) (Sigma) par lavage. Récolte des cellules lavées aussi par centrifugation à 1900 rpm pendant 10 minutes. Remettre en suspension les cellules lavées dans 1 ml de tampon de reconstruction (0,2 N NaOH solution avec du bicarbonate de sodium 2,2% (poids / volume) et de 4,8% (poids / volume) HEPES, pH 7,2).
REMARQUE: C. albicans est un microorganisme 1/BSL1 des risques du Groupe. Rappelez-vous toujours d'utiliser les bonnes techniques aseptiques / stériles pour le travail avec ce micro-organisme et de suivre les procédures institutionnelles pour une élimination appropriée des matières infectieuses.
- Compter les cellules en utilisant un hemocytOmeter sur un microscope à champ clair et de s'adapter à une densité cellulaire de 5 x 10 7 cellules par millilitre.
- Diluer la suspension dix fois par addition de 10 × RPMI-1640 supplémenté avec L-glutamine et tamponnée avec morpholinepropanesulfonic (MOPS) d'acide (pH 7,2).
- Encapsuler les cellules de levure dans le collagène en mélangeant la suspension de cellules dans un milieu RPMI-1640 avec le collagène (1,8 mg / ml) (type 1 de queue de rat, BD Biosciences, Bedford, MA), pour obtenir une concentration finale de 4 × 10 6 cellules / ml. Garder la suspension de collagène-cellule sur la glace pour empêcher la gélification de collagène avant l'impression.
3. Préparation de Ca BChip
- Nettoyer et désinfecter les surfaces de la microarrayer, y compris la plaque station source, de lavage et de la station à vide, plateau coulissant sous vide et la chambre d'impression, par essuyage avec 70% d'isopropanol.
- Placez et maintenez par le vide le nombre souhaité de lames de verre PS-MA-enduits sur le jeu de diapositives de la microroarrayer.
- Vortex de la suspension cellulaire en collagène vigoureusement et aspirer 100 pl de la suspension bien mélangée dans un puits d'une plaque de 96 puits, juste avant l'impression. Placer cette plaque de source dans le poste de chargement.
- Mettez l'humidificateur pour maintenir une humidité relative de 100% dans la chambre de puces tout au long du processus d'impression.
- Imprimer 50 NL de la suspension cellulaire dans un tableau de 48 lignes et 16 colonnes avec des taches espacées de 1,2 mm en dehors à l'aide d'un observateur puces à ADN (Omnigrid Micro, Inc Digilab, Holliston, MA) par des non-contact en utilisant le dépôt conique 190 conseils um orifice en céramique (Digilab).
- Premier, rincer et sécher sous vide des conseils à deux reprises après chaque tour de l'impression.
- Immédiatement après l'impression, placer la lame dans une étanche à l'air, chambre humidifiée (cassette hybridation, ARRAYIT Corporation, Sunnyvale, CA) et incuber à 37 ° C pendant 24 heures pour permettre la formation de biofilm.
4. Test de sensibilité de PrLes biofilms dans eformed Ca BChip contre les agents antifongiques
- Partir de solutions mères ou de la poudre de médicaments antifongiques, préparer une solution de travail en milieu RPMI-1640. Typiques des concentrations maximales de la solution de travail sont 1024 pg / mL pour le fluconazole et 16 pg / ml pour l'amphotéricine B 5. D'autres concentrations peuvent être utilisés pour différents agents.
- Préparer huit concentrations différentes du composé en diluant la solution stock dans deux dilutions, couvrant une plage avec l'estimation de IC 50 du composé dans le milieu.
- Après 24 h de la croissance du biofilm, utilisez le microarrayer d'imprimer 50 NL de huit différentes concentrations des médicaments, ainsi que positif (c.-à-pas de cellules de drogues dans les médias seulement) et négatifs (traité à l'hypochlorite de sodium pendant 20 min) les contrôles, au moins six répétitions au-dessus des biofilms.
REMARQUE: Maintenir une humidité relative de 100% pour éviter le séchage des taches tout en complémentd'ING médicaments.
- Peu de temps après l'ajout des médicaments, incuber la puce avec les médicaments dans une chambre humide à 37 ° C pendant 24 heures.
- Laver les médicaments hors de tremper l'CaBChip 3-5 fois pendant 2 min à chaque fois dans du PBS et la tache par incubation de la BChip Ca avec 0,5 uM MIN1 à 37 ° C pendant 30 min 9.
- Lavez la tache avec de tremper l'BChip Ca 3-5 fois dans du PBS pendant 1-3 min à chaque dunk, et sécher le BChip Ca aide d'un courant d'azote. Lire l'intensité de fluorescence à l'aide d'un scanner de microréseau (GenePix 4100A, Axon Instruments, CA) à une longueur d'onde de 532 nm avec un gain de 380 PMT.
- Réglez l'intensité de fluorescence du contrôle positif (aucun médicament) et mortes (eau de Javel-traités) taches biofilm à 100% et 0%, respectivement.
- Déterminer le pourcentage d'inhibition par la réduction de l'intensité de fluorescence (F) par rapport à la moyenne des taches de contrôle en utilisant l'équation suivante
où F, F max et F o sont premières intensités de fluorescence de la drogue traitée, sans contrôle des drogues et de blanchiment traités par taches, respectivement. Les paramètres du scanner ont été ajustés pour obtenir F max et F o de 30000 et 4000 RFU, respectivement.
- Calculer la concentration inhibitrice 50% ou IC 50 en ajustant l'équation pente variable colline en utilisant le logiciel GraphPad Prism (La Jolla, CA).
5. Les résultats représentatifs
Un représentant Ca BChip, constitué d'un 48 × 16 gamme de nano-biofilms de C. albicans, est représenté sur la figure 2. La microscopie sur fond clair montre une caractéristique architecturale d'ensemble de la nano-biofilm. Les images microscopiques électronique à balayage de la série biofilm que les hyphes fongiques sont incorporés dans la matrice defibres de collagène, qui sont approximativement 2 pm et 100 nm de diamètre, respectivement. Les images MIN1 tachés de scanner puces montrent la levure et les formes des hyphes, qui sont caractéristiques des biofilms fongiques. Les images 2D et 3D confocale de fluorescence de MIN1 tachés de biofilms peut être considéré comme ayant l'hétérogénéité spatiale, avec des régions de cellules métaboliquement actives entrecoupées sein de la matrice extracellulaire (composé de collagène comme le matériau d'encapsulation et très probablement aussi, du matériel produit par exopolymériques cellules de biofilm), ce qui n'est pas souillé par le colorant métabolique. L'épaisseur du biofilm a été estimée à environ 50 um. Le BChip Ca a été utilisée pour estimer la sensibilité aux antifongiques de deux médicaments, le fluconazole et l'amphotéricine B, et les résultats sont présentés dans la figure 3. Conformément aux rapports publiés sur des essais standard de l'industrie de la plaque de 96 puits, les biofilms sont résistants contre le fluconazole 10 et le calcul IC 50 pour amphotéricine B est de 0,3 pg / ml 11.
Diagramme Figure 1. Pour la fabrication de Ca BChip.
Figure 2. Une image de la BChip haute thoughput Ca, imprimé en utilisant une microarrayer robotique et contenant 768 points sur PS-MA-lames recouvertes. Chaque spot est de 50 nL hémisphérique en volume, environ 700 m de diamètre, et avec une séparation de 1,2 mm entre les points. On voit également (dans le sens horaire) sont la microscopie optique, scanner puces à ADN, la microscopie 2D et 3D de fluorescence, et la numérisation d'images en microscopie électronique des biofilms individuelles sur le BChip Ca. Le chiffre SEM à fort grossissement de 25.000 x montre un filament hyphes de largeur 2 um.
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Figure 3. Résultats des tests de sensibilité antifongique et la détermination des valeurs de CI50 pour (A) au fluconazole et (B) en utilisant l'amphotéricine B Ca BChip. Les images de microscopie de fluorescence de l'amphotéricine B traités par les biofilms sont présentés dans (C). Les résultats sont la moyenne ± écart-type moyen de deux puces distinctes contenant 10 répétitions pour chaque condition.
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Discussion
Nous avons développé une cellule à base de puces à ADN de haute densité, Ca BChip, composé de volumes nanolitre des biofilms de Candida albicans. La puce a été imprimé sur du verre modifiée substrats, ce qui a permis pour la fixation solide de taches gel de collagène tout en fournissant hydrophobicité nécessaire pour un non-propagation, gel 3D hémisphérique. Un seul Ca BChip peut remplacer environ huit plaques à 96 puits, et plusieurs puces peuvent être imprimées et traitées en même temps. La puce utilise nano-échelle des cultures, permet une manipulation facile et rapide, est soumise à l'automatisation, minimise le travail manuel et les coûts et est entièrement compatible avec la technologie des puces standard et l'équipement. En outre, la technologie est flexible et peut être facilement adapté à d'autres microorganismes. Malgré la miniaturisation, les nano-biofilms formés sur les propriétés d'affichage Ca BChip qui sont caractéristiques de la C. albicans biofilm mode de vie, y compris en 3D ARCHITECTUREe et la résistance aux médicaments. Ainsi, le BChip Ca permet d'une véritable criblage à haut débit, et a le potentiel pour un changement de paradigme dans la découverte de médicaments antimicrobiens.
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Disclosures
Jose L. Lopez-Ribot et Anand K. Ramasubramanian capitaux propres dans les technologies MicrobeHTS, Inc, qui est le développement d'agents antifongiques. Technologies MicrobeHTS, Inc fourni aucun soutien financier pour ces études.
Acknowledgments
Ce travail a été financé en partie par des subventions de la Direction de la technologie du sud du Texas (POCrr 2,009,041), l'Institut pour l'intégration de la médecine et des sciences à partir du Centre National de Ressources de recherche (UL 1RR025767), et de l'Institut national de recherche dentaire et craniofaciale ( 5R21DE017294).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 | |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 | |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A | |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A | |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD | |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 | |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 | |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC | |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | ||
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
References
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