Summary
Мы разработали высокой плотности микрочипов платформа, состоящая из 3D нано-биопленки из
Abstract
Candida Albicans остается основным этиологическим агентом кандидоз, который в настоящее время является четвертым наиболее распространенных внутрибольничных инфекций кровотока в больницах США 1. Эти оппортунистические инфекции представляют собой растущую угрозу для все большего числа зараженных людей, и нести неприемлемо высокой смертности. Отчасти это связано с ограниченным арсеналом противогрибковые препараты, но и к появлению устойчивости к наиболее часто используемым противогрибковые препараты. Еще больше осложняет лечение является тот факт, что большинство проявления кандидоза, связанные с образованием биопленок, а клетки в этих биопленки показывают повышение уровня устойчивости к наиболее клинически использовать противогрибковые препараты 2. Здесь мы описываем развитие высокой плотности микрочипов, которая состоит из C. Albicans нано-биопленки, которые мы назвали Ca BChip 3. Короче говоря, робот microarrayer используется то печати дрожжевых клеток C. Albicans на твердую подложку. Во время печати, дрожжевые клетки заключены в трехмерную матрицу, используя объем всего 50 нл и иммобилизованных на стеклянную подложку с подходящим покрытием. После первоначальной печати, слайды инкубируют при 37 ° C в течение 24 часов, чтобы обеспечить развитие биопленки. В этот период пятна превращаются в полностью разработан "нано-биопленки", которые отображают типичные структурные и фенотипические характеристики, связанные со зрелыми C. Albicans биопленки (т.е. морфологической сложности, трехмерная архитектура и лекарственная устойчивость) 4. В целом, Ca BChip состоит из ~ 750 эквивалентны и пространственно различных биопленок, с дополнительным преимуществом, что несколько чипов могут быть распечатаны и обрабатываются одновременно. Жизнеспособность клеток оценивается путем измерения интенсивности флуоресценции от fun1 метаболических пятно с помощью сканера микрочипов. Это грибковое чип идеально подходит для итаковой в истинном высокопроизводительного скрининга для противогрибковых лекарств. По сравнению с действующими стандартами (например, 96-а планшет модель биопленки 5), основные преимущества грибковых чип биопленки являются автоматизация, миниатюризация, экономия на количестве и стоимости реагентов и анализ времени, а также ликвидация труда интенсивные шаги. Мы считаем, что такой чип позволит значительно ускорить процесс противогрибковые лекарств.
Protocol
1. Подготовка функционализированных Слайды
- Поместите микроскоп слайды в съемную стойку слайд, и мыть дважды погружение в окрашивании сосуд, содержащий 99% этанола (гистологического класса). Протрите слайды очистки с использованием бумажных полотенец (обеспечение не создавать бумажную пыль), и сухой струей газа сжатого азота.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте Ким-салфетки для протирки слайдов, как он будет генерировать пыль бумаги.
- Погрузите слайд стойку содержащий слайды в окрашивании сосуд, наполненный концентрированной серной кислоты и инкубируют при комнатной температуре в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того чтобы избежать контакта с кожей, использовать химически стойкие перчатки и защитные очки при работе с концентрированными кислотами и токсичных и едких химикатов.
- Разрушать ультразвуком слайды в течение 30 минут и промыть Milli-Q (18 МОм) воде в течение 30 мин, с другой следуют мыть вкетон в течение 5 мин. Эта процедура предоставляет силанольных групп на поверхности стекла.
- Шерсть чистая слайды с 2,5% (объем / объем в воде) 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES) решения, путем погружения слайда в стойку APTES в течение 30 мин, стиральная 3 раза в Milli-Q воды в течение 15 минут в каждом мытье, и выпечка слайды в печи при температуре 110 ° С в течение 15 мин. Выпечки позволяет сшивки APTES, в результате чего-NH2-функционализации поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, APTES решение в пластиковый контейнер с APTES депозиты преимущественно на стенках стеклянной таре.
- Использование спина для нанесения покрытий, пальто слайды с 1% (вес / объем в толуоле) Полистирол-Co-малеинового ангидрида (PS-MA) (Sigma), чтобы достичь моно-слой гидрофобного покрытия 6. Добавить 2,0 мл ПС-MA на чистое предметное стекло устанавливается на спину и для нанесения покрытий покрытия на 3000 оборотов в минуту в течение 30 сек. Эти условия могут варьироваться в зависимости от спина покрытие такие параметры, как покрытие такlution, подложки, толщина покрытия и определяется следующим уравнением 7
где А является толщина пленки покрытия, е-скорость испарения, η, С и ρ являются вязкость, концентрация и плотность покрытия решения, соответственно, ω угловая скорость.
ПРИМЕЧАНИЕ: толуол вредно при вдыхании в течение длительного времени и использование вытяжки рекомендуется.
- Слайды могут быть сохранены в режиме слайд-стойку на срок до одного месяца в сухом, защищенном от пыли условиях при температуре 2 - 8 ° C.
2. Подготовка посевного материала дрожжей и коллагена инкапсуляции
- Подготовить ночной культуры С. Albicans штамма SC5314, у дрожжей Пептон Декстроза [YPD, 10 г / л дрожжевого экстракта, 20 г / л пептона и 20 г / л, глюкоза] жидкой среде путем посева одной колонии C. др.bicans в 10 - 20 мл YPD 8. Инкубируйте культуры в орбитальном шейкере (около 150 - 200 оборотов в минуту) при температуре 30 ° С в течение ночи. Урожай 1 мл Candida Albicans дрожжевых клеток от одного дня YPD культур (путем центрифугирования при 5000 оборотов в минуту в течение 5-10 минут) и мыть дважды в течение 10 мин в 1 мл стерильного фосфатного буфера (PBS, 10 мМ фосфатный буфер, 2,7 мМ хлористого калия, 137 мМ хлорида натрия, рН 7,4) (Sigma) в стирке. Урожай мыть клетки также путем центрифугирования при 1900 оборотов в минуту в течение 10 минут. Ресуспендируют отмытых клеток в 1 мл реконструкции буфера (0,2 N NaOH раствора с 2,2% (вес / объем) бикарбоната натрия и 4,8% (вес / объем) HEPES, рН 7,2).
ПРИМЕЧАНИЕ: C. Albicans является 1/BSL1 группы риска микроорганизмов. Всегда помните, чтобы использовать хороший асептических / стерильных методов для работы с этим микроорганизмом и последующих институциональных процедур для правильной утилизации биологически опасных материалов.
- Граф клеток с использованием hemocytometer на ярком поле микроскопа и адаптироваться к плотности клеток 5 × 10 7 кл / мл.
- Дальнейшее разбавление подвески в десять раз путем добавления 10 × RPMI-1640 дополнена L-глютамин и буфером с morpholinepropanesulfonic (MOPS) кислоты (рН 7,2).
- Инкапсуляция дрожжевых клеток в коллаген путем смешивания суспензии клеток в RPMI-1640 с коллагеном (1.8 мг / мл) (тип 1 от крысиного хвоста, BD Biosciences, Бедфорд, штат Массачусетс), для получения конечной концентрации 4 × 10 6 кл / мл. Держите коллагена клеточной суспензии на льду для предотвращения гелеобразования коллагена перед печатью.
3. Подготовка Ca BChip
- Очистка и дезинфекция всех поверхностей microarrayer, в том числе станция источник плита, мойка и вакуумная станция, блюдо горкой и вакуумной камере печати, путем протирания 70% изопропанола.
- Установите и удерживайте вакуумной необходимое количество ПС-МА-покрытием предметные стекла на слайды из микрофонаroarrayer.
- Vortex суспензии клеток в коллаген активно и аспирации 100 мкл хорошо перемешанной суспензии в лунку 96-луночного планшета, непосредственно перед печатью. Поместите этот источник пластины в загрузке станции.
- Включите увлажнитель для поддержания относительной влажности 100% микрочипов камера течение всего процесса печати.
- Печать 50 нл суспензии клеток в виде массива из 48 строк и 16 столбцов с пятнами расстоянии 1,2 мм друг от друга использованием микрочипов корректировщик (Omnigrid Micro, Digilab Inc, Holliston, MA) по бесконтактным осаждения использованием конической конических отверстий 190 мкм керамических советы (Digilab).
- Премьер, промыть и высушить вакуумным советов в два раза после каждого раунда печати.
- Сразу же после печати, поместите слайд герметичные, влажной камере (гибридизация кассеты, ArrayIt Corporation, Саннивейл, Калифорния) и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 24 часов, чтобы обеспечить формирование биопленок.
4. Восприимчивость испытания пр.eformed биопленки в Ca BChip против противогрибковых препаратов
- С растворы или порошок противогрибковые препараты, готовить рабочий раствор в RPMI-1640. Типичные максимальные концентрации рабочего раствора 1024 мкг / мл флуконазола и 16 мкг / мл амфотерицина 5. Другие концентрации могут быть использованы для различных веществ.
- Подготовка восьми различных концентраций соединения путем разбавления исходного раствора в два раза разведения, охватывающий диапазон оценкам IC 50 соединения в середине.
- После 24 часов биопленки роста, использовать microarrayer необходимо напечатать 50 нл восьми различных концентраций препаратов, наряду с положительными (не наркотик, т.е. клетки только в средствах массовой информации) и отрицательные (лечение гипохлоритом натрия в течение 20 мин) контроль, по крайней мере, шесть повторяет в верхней части биопленки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание относительной влажности 100%, чтобы предотвратить высыхание места в то время как надстройкав G наркотиков.
- Вскоре после добавления препаратов, инкубировать чипа с наркотиками во влажной камере при температуре 37 ° С в течение 24 часов.
- Промойте от наркотиков по макая CaBChip 3-5 раз в течение 2 минут каждый раз, когда в ФСБ и пятна путем инкубации Ca BChip с 0,5 мкМ fun1 при 37 ° С в течение 30 минут 9.
- Промойте пятно от по макая Ca BChip 3-5 раза в PBS в течение 1-3 мин каждый замочить и высушить BChip Ca помощью токе азота. Читайте интенсивность флуоресценции с помощью сканера микрочипов (GenePix 4100A, Axon Instruments, CA) на длине волны 532 нм с коэффициентом усиления ФЭУ 380.
- Установите интенсивность флуоресценции положительного контроля (без наркотиков) и мертвые (отбеливатель обработанных) биопленки пятна на 100% и 0% соответственно.
- Определить процент торможения за счет снижения интенсивности флуоресценции (F) по отношению к среднему управления пятна по следующей формуле
где F, F и F максимальная о сырые интенсивности флуоресценции с наркотиками лечение, не-по контролю над наркотиками и отбеливатель обработанные места, соответственно. Параметры сканера были скорректированы для получения F макс и F о 30000 и 4000 РФС, соответственно.
- Рассчитать 50% ингибирующая концентрация или IC 50 путем установки переменной уравнения Хилла склоне использованием GraphPad Prism программы (Ла-Хойя, Калифорния).
5. Представитель Результаты
Представитель Ca BChip, состоящий из 48 × 16 массив нано-биопленки С. Albicans, показана на рисунке 2. Яркие области микроскопии показывает общую архитектурную особенность нано-биопленки. Сканирующего электронного микроскопа изображение биопленки показывают, что гифы гриба встроены в матрицуколлагеновых волокон, которые являются около 2 мкм и диаметром 100 нм, соответственно. Fun1 окрашенных образов микрочипов сканер показать дрожжей и гиф формы, характерные для грибов биопленки. 2D-и 3D-конфокальной флуоресцентной изображения fun1 окрашенных биопленки можно увидеть, чтобы иметь пространственную неоднородность, с регионами метаболически активных клеток перемежаются в внеклеточного матрикса (состоящий из коллагена, инкапсуляции материалов и, скорее всего, также exopolymeric материала, произведенного биопленки клеток), которая не запятнана метаболических красителя. Толщина биопленки, по оценкам, составит около 50 мкм. Ca BChip была использована для оценки чувствительности противогрибковых двух препаратов, флуконазол и амфотерицин, а результаты представлены на рисунке 3. В соответствии с опубликованным отчетам на стандартных 96-и анализы пластины, биопленки устойчивы к флуконазолу 10 и рассчитывается IC 50 амфотерицин В 0.3 мг / мл 11.
Рисунок 1. Схема для изготовления Ca BChip.
Рисунок 2. Картины высокого thoughput Ca BChip, печатаются с использованием робота microarrayer и содержащий 768 точек на PS-МА-покрытием слайды. Каждый полусферической месте составляет 50 нл в объеме, примерно 700 мкм в диаметре, и с 1,2 мм расстояние между пятнами. Также показаны (по часовой стрелке) являются световой микроскопии, микрочипов сканер, 2D-и 3D-флуоресцентной микроскопии и сканирующей электронной микроскопии изображений отдельных биопленки на Ca BChip. На рисунке SEM при большом увеличении 25000 х показывает гиф нить шириной 2 мкм.
Рисунок 3 "SRC =" / files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Результаты тестов на чувствительность к противогрибковым и определения IC 50 значений (A) и флуконазол (B) амфотерицин использованием Ca BChip. Флуоресцентных изображений микроскопа амфотерицин обработанных биопленки представлены в (С). Результаты среднее ± стандартная ошибка означает для двух отдельных чипов, содержащих 10 репликации для каждого состояния.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы создали ячейку на основе высокой плотности микрочипов, Ca BChip, состоящий из nanoliter объемы Candida Albicans биопленки. Микрочипов был напечатан на изменения стеклянные подложки, что позволило надежных вложений пятен коллагеновый гель, обеспечивая при этом необходимую для гидрофобность, не распространяется, полусферической 3D геля. Один Ca BChip может заменить около восьми 96-луночных планшетах, и несколько микросхем могут быть распечатаны и обрабатываются одновременно. Чип использует нано-культуры, позволяет легко и быстро обращения, поддается автоматизации, сводит к минимуму ручной труд и затраты, и полностью совместим со стандартом технологии микрочипов и оборудования. Кроме того, технология является гибкой и может быть легко адаптирована к другим микроорганизмам. Несмотря на миниатюризацию, нано-биопленки образуются на Ca BChip дисплей свойства, которые характерны для C. Albicans биопленки образа жизни, включая 3D-архитектурныеэлектронной и лекарственной устойчивости. Таким образом, Ca BChip позволяет истинным высокопроизводительного скрининга, а также имеет потенциал для смены парадигмы в антимикробных лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Хосе Л. Лопес-Рибо и Ананд К. Ramasubramanian собственного капитала в MicrobeHTS Technologies, Inc, которая занимается разработкой противогрибковых средств. MicrobeHTS Technologies, Inc представила никаких финансовую поддержку этих исследований.
Acknowledgments
Эта работа была частично финансируется за счет субсидий из Южного Техаса Management Technology (POCrr 2009,041), Институт интеграции медицины и наук из Национального центра по изучению ресурсов (UL 1RR025767), а также из Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований ( 5R21DE017294).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 | |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 | |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A | |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A | |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD | |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 | |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 | |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC | |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | ||
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
References
- Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
- Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
- Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
- Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
- Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).
