Summary
פיתחנו פלטפורמה בצפיפות גבוהה microarray המורכב 3D ננו biofilms של
Abstract
קנדידה אלביקנס נשאר סוכן etiological העיקרי של קנדידה, אשר מהווה כיום את הזיהום 4 הנפוץ ביותר בדם nosocomial בבתי חולים בארה"ב 1. אלו זיהומים אופורטוניסטים מהווים איום הולך וגדל עבור מספר הולך וגדל של אנשים שנפגעו, ולבצע שיעורי תמותה גבוהים בלתי מתקבל על הדעת. זאת בין השאר בשל מאגר מוגבל של תרופות נגד פטריות, אלא גם את הופעתה של עמידות נגד תרופות נגד פטריות הנפוצים ביותר. נוסף שמסבך הטיפול היא העובדה כי רוב גילויי קנדידה קשורים להיווצרות של biofilms, והתאים בתוך biofilms אלה מראים רמות גבוהות של התנגדות לסוכנים נגד פטריות ביותר בשימוש קליני 2. כאן אנו מתארים את הפיתוח של microarray בצפיפות גבוהה שמורכבת ג אלביקנס ננו biofilms, אשר יש לנו בשם Ca BChip 3. בקצרה, microarrayer רובוטית משמש לאשמרים פלט הדפסה תאים של ג אלביקנס על מצע מוצק. במהלך ההדפסה, התאים שמרים מוקפים מטריקס תלת מימדי באמצעות בנפח נמוך כמו 50 NL ו משותקת על מצע זכוכית עם ציפוי מתאים. לאחר ההדפסה הראשונה, השקופיות מודגרת על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, כדי לאפשר פיתוח biofilm. במהלך תקופה זו כתמים לגדול לתוך מפותחת "ננו" כי biofilms להציג מאפיינים מבניים פנוטיפי טיפוסיות הקשורות ג בוגרת biofilms אלביקנס (כלומר המורכבות המורפולוגית, 3 אדריכלות ממדי עמידות לתרופות) 4. בסך הכל, BChip Ca מורכב של ~ 750 biofilms מקבילים וברורים מרחבית, עם יתרון נוסף שבבים מרובים ניתן להדפיס ומעובד בו זמנית. כדאיות התא מוערך על ידי מדידת עוצמת ניאון של חילוף החומרים FUN1 כתם באמצעות סורק microarray. שבב זה פטרייתי הוא אידיאלי עבור USE ההקרנה תפוקה גבוהה לגבי גילוי תרופות נגד פטריות. לעומת הסטנדרטים הנוכחיים (קרי: 96-microtiter גם הצלחת המודל של היווצרות biofilm 5), היתרונות העיקריים של השבב biofilm פטרייתי הם אוטומציה, המזעור, חיסכון בסכום עלות של חומרים כימיים וזמן הניתוח, כמו גם ביטול העבודה צעדים נמרצים. אנו מאמינים כי שבבים כאלה באופן משמעותי להאיץ את תהליך גילוי תרופות נגד פטריות.
Protocol
1. הכנת שקופיות פונקציונליות
- מניחים את שקופיות מיקרוסקופ במעמד שקופית נשלף, ולשטוף פעמיים ידי טבילה בצנצנת מכתים המכיל אתנול 99% (כיתה היסטולוגית). נגב השקופיות לנקות בעזרת מגבות נייר (הבטחת לא ליצור אבק נייר), ויבש באמצעות סילון של גז חנקן דחוס.
הערה: אין להשתמש קים, מגבונים כדי לנגב את השקופיות כפי שהוא יעורר אבק נייר משובח.
- לטבול את מתלה השקופית המכילה את השקופיות בצנצנת מכתים מלא חומצה גופרתית דגירה מרוכז בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
הערה: כדי להימנע ממגע עם העור, השתמש כימיים עמידים כפפות ומשקפי בטיחות תוך כדי עבודה עם חומצות מרוכזות וכימיקלים רעילים מאכל.
- Sonicate השקופיות למשך 30 דקות ולאחר לשטוף עם מילי-Q (18 MΩ) במים למשך 30 דקות, פעל עם לשטוף אחרcetone במשך 5 דקות. טיפול זה חושף את קבוצות silanol על משטח זכוכית.
- מעיל השקופיות נקיים עם 2.5% (כרך א '/ כרך במים) של 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) הפתרון, על ידי טבילה המדף שקופית APTES למשך 30 דקות, לשטוף 3 פעמים במים מילי-Q במשך 15 דקות כל שטיפה, ואפייה את השקופיות בתנור ב 110 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. אפייה מאפשר cross-linking של APTES, וכתוצאה מכך functionalization-NH2 של פני השטח.
הערה: הפוך את הפתרון APTES במיכל פלסטיק מאז פיקדונות APTES מועדף על קירות מיכל זכוכית.
- באמצעות coater ספין, מעיל השקופיות עם% 1 (WT / כרך ב טולואן) פוליסטירן-Co-maleic אנהידריד (PS-MA) (Sigma) כדי להשיג מונו שכבת ציפוי הידרופובי 6. הוסף 2.0 מ"ל של PS-MA על גבי זכוכית נושאת נקייה רכוב על coater ספין ומעיל בסל"ד 3000 למשך 30 שניות. תנאים אלה עשויים להשתנות בהתאם ציפוי ספין פרמטרים כגון ציפוי כל כך, המצע lution, עובי של ציפוי נשלטת על ידי המשוואה הבאה 7
כאשר h הוא עובי ציפוי הסרט, דואר הוא שיעור התאדות, η, C ו ρ הם, צמיגות ריכוז וצפיפות של פתרון ציפוי, בהתאמה, ω היא המהירות הזוויתית.
הערה: טולואן מזיק כאשר בשאיפה זמן שימוש ארוך של במנדף מומלץ.
- השקופיות ניתן לאחסן במעמד שקופיות של עד חודש אחד יבש, נקי מאבק, התנאים בבית 2-8 ° C.
2. הכנת Inocula שמרים ו Encapsulation קולגן
- הכן את תרבות הלילה של ג אלביקנס זן SC5314, ב שמרים Peptone דקסטרוז [YPD: 10 גר '/ שמרים תמצית L, 20 גר' / ל 'peptone ו 20 גר' / ל דקסטרוז] בינוני נוזל ידי יחסנו מושבה אחת של ג אלbicans תוך 10-20 מ"ל של YPD 8. דגירה תרבות שייקר מסלולית (כ 150-200 סל"ד) על 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה. קציר 1 מ"ל קנדידה אלביקנס שמרים תאים מתרבויות YPD לילה (על ידי צנטריפוגה בסל"ד 5000 למשך 5-10 דקות) ושוטפים פעמיים 10 דקות ב 1 מ"ל של פוספט סטרילית בופר סליין (PBS: 10 פוספט mM חיץ, 2.7 mM אשלגן כלורי, 137 נתרן כלורי מ"מ, ה-pH 7.4) (Sigma) לכל כביסה. קציר שטף תאים גם על ידי צנטריפוגה בסל"ד 1900 למשך 10 דקות. Resuspend התאים שטף במאגר 1 שיקום מ"ל (0.2 N NaOH פתרון עם סודה לשתייה 2.2% (wt / כרך א ') ו - 4.8% (wt / כרך א') HEPES, pH 7.2).
הערה: ג אלביקנס היא קבוצת סיכון מיקרואורגניזם 1/BSL1. זכרו תמיד להשתמש בטכניקות אספטיים / סטרילי טובים לעבודה עם מיקרואורגניזם זה ופעל נהלים מוסדיים לסילוק נאות של חומרים ביולוגית מסוכנת.
- ספירת תאים באמצעות hemocytometer על מיקרוסקופ שדה בהיר להתאים את צפיפות התאים של 5 × 10 7 תאים למ"ל.
- יתר על כן לדלל את ההשעיה פי עשרה על ידי תוספת של 10 × RPMI-1640 השלימו עם גלוטמין-L ו שנאגרו עם morpholinepropanesulfonic (מגבים) חומצה (pH 7.2).
- לתמצת את התאים השמרים קולגן על ידי ערבוב ההשעיה תא RPMI-1640 עם קולגן (1.8 מ"ג / מ"ל) (סוג 1 מזנב החולדה, BD Biosciences, בדפורד, מסצ'וסטס), כדי לקבל ריכוז סופי של 4 × 10 6 תאים / מ"ל. שמור על ההשעיה קולגן תאים על הקרח כדי למנוע gelation של קולגן לפני ההדפסה.
3. הכנת Ca BChip
- לנקות ולחטא את כל פני השטח של microarrayer, כולל לשטוף צלחת המקור, ואת תחנת החלל, השקופית צלחת ואקום קאמרית ההדפסה, על ידי מנגב עם 70% isopropanol.
- מניחים על ידי לחיצה ארוכה ואקום המספר הרצוי של PS-MA מצופים שקופיות זכוכית על הסיפון שקופיות של מיקרופוןroarrayer.
- המערבולת ההשעיה תא קולגן במרץ לשאוב 100 μL ההשעיה היטב מעורבת לבאר צלחת 96-טוב, ממש לפני ההדפסה. מניחים את הצלחת המקור בתחנת הטעינה.
- הפעל את מכשיר האדים כדי לשמור על לחות יחסית של 100% בחדר microarray לאורך כל תהליך ההדפסה.
- הדפס 50 NL ההשעיה תא במערך של 48 שורות ו -16 עמודות עם נקודות במרווחים 1.2 מ"מ זה מזה באמצעות הצופה microarray (Omnigrid Micro, Digilab בע"מ, Holliston, MA) של בתצהיר ללא מגע באמצעות מחודדות conically מיקרומטר טיפים -190 פתח קרמיקה (Digilab).
- ראש הממשלה, לשטוף ואקום לייבש את הטיפים פעמיים אחרי כל סיבוב של ההדפסה.
- מיד לאחר ההדפסה, למקם את השקופית בחדר, מיזוג חזק humidified (קלטת הכלאה, ArrayIt Corporation, Sunnyvale, CA) ואת דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי לאפשר היווצרות biofilm.
4. בדיקת הרגישות של יחסי ציבורeformed Biofilms בע"א BChip נגד סוכנים נגד פטריות
- מפתרונות מניות או אבקה של תרופות נגד פטריות, להכין פתרון עובד בינוני 1640 RPMI. ריכוזים היותר אופייניות של הפתרון עובד הם 1,024 מיקרוגרם / מ"ל עבור fluconazole ו 16 מיקרוגרם / מ"ל של amphotericin B 5. ריכוזים אחרים עשויים לשמש סוכנים שונים.
- הכן שמונה ריכוזים שונים של המתחם על ידי דילול פתרון המניות כפולה דילולים, פורש טווח עם IC מוערך של 50 במתחם באמצע.
- אחרי 24 שעות של צמיחה biofilm, השתמש microarrayer להדפיס 50 NL שמונה ריכוזים שונים של תרופות, יחד עם חיובי (כלומר, אין סמים תאים בתקשורת בלבד) והשלילי (שטופלו hypochlorite נתרן במשך 20 דקות) שולטת, לפחות 6 משכפל על גבי biofilms את.
הערה: יש לשמור על לחות יחסית של 100% כדי למנוע ייבוש של כתמים תוך הרחבהמחודשת של תרופות.
- זמן קצר לאחר מכן להוסיף את התרופות, דגירה שבב עם הסמים בתא humidified על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- לשטוף את הסמים הנחה על ידי טבילת CaBChip 3-5 פעמים 2 דקות בכל פעם ב PBS וכתם על ידי דוגרים BChip CA עם 0.5 מיקרומטר FUN1 על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות 9.
- לשטוף את הכתם מעל ידי טבילת BChip Ca 3-5 פעמים PBS 1-3 דקות בכל דאנק, ומייבשים BChip Ca באמצעות זרם חנקן. קרא את עוצמת הקרינה באמצעות סורק microarray (GenePix 4100A, אקסון מכשירים, CA) באורך גל של 532 ננומטר עם רווח של 380 PMT.
- הגדר את עוצמת הקרינה של שליטה חיובית (ללא תרופות) ואת המלח (אקונומיקה) שטופלו נקודות biofilm ב 100% ו - 0%, בהתאמה.
- לקבוע את אחוז עיכוב על ידי הפחתת עוצמת הקרינה (F) יחסית לממוצע הנקודות שליטה באמצעות המשוואה הבאה
שם F, F Max ו-F o הן עוצמות הקרינה הגלם של טיפול תרופתי, ללא התרופה בקרה אקונומיקה שטופלו נקודות, בהתאמה. הגדרות הסורק הותאמו להשיג מקסימום F ו-F O של 30000 ו 4000 RFU, בהתאמה.
- חשב את ריכוז מעכבות 50% או 50 IC ידי התאמת שיפוע משתנה היל משוואה באמצעות תוכנת GraphPad פריזמה (La Jolla, CA).
5. נציג תוצאות
Ca נציג BChip, בהיקף של 48 × 16 מערך של ננו biofilms של C. אלביקנס, מוצגת באיור 2. מיקרוסקופ שדה בהיר מראה אדריכלי הכולל של ננו biofilm. התמונות סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים של התוכנית biofilm כי העובש הפטרייתי המוטבעות בתוך המטריצה שלסיבי קולגן, שהם כ 2 מיקרומטר ו -100 ננומטר בקוטר, בהתאמה. את FUN1 המוכתמים סורק תמונות microarray להראות את השמרים וצורות hyphal, האופייניים של biofilms פטרייתיים. התמונות הקרינה 2 ד ו 3D-confocal של FUN1 המוכתמים biofilms ניתן לראות שיש הטרוגניות מרחבית, עם אזורים של תאים פעילים מטבולית וביניהם בתוך המטריצה תאי (מורכב קולגן כחומר בבועה וככל הנראה גם של חומר המיוצר על ידי exopolymeric biofilm תאים), אשר אינו המגואלות צבע מטבולית. עובי של biofilm היה מוערך להיות כ 50 מיקרומטר. BChip Ca שימש כדי להעריך את הרגישות של שתי תרופות נגד פטריות, fluconazole ו amphotericin B, והתוצאות מוצגות באיור 3. עולה בקנה אחד עם דיווחים שפורסמו על תקן התעשייה 96, גם מבחני צלחת, biofilms הם עמידים נגד fluconazole 10 ו IC מחושב 50 עבור amphotericin B הוא 0.3 מיקרוגרם / מ"ל 11.
1. תרשים זרימה תרשים עבור ייצור של Ca BChip.
איור 2. תמונה של גבוה thoughput Ca BChip, מודפס באמצעות microarrayer רובוטית, אשר מכיל 768 מקומות על PS-MA מצופים שקופיות. כל נקודה חצי כדור הוא 50 NL בהיקף כ 700 מיקרומטר בקוטר, ועם הפרדה 1.2 מ"מ בין נקודות. הראו גם (בכיוון השעון) הם מיקרוסקופ אור, סורק microarray, מיקרוסקופיה 2D ו-3D-הקרינה, וכן סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של biofilms בודדים על BChip Ca. דמות SEM בהגדלה גבוהה של 25,000 X מראה נימה hyphal של 2 מיקרומטר רוחב.
איור 3 "src =" / files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg "/>
איור 3. תוצאות של בדיקות רגישות ונחישות נגד פטריות וגם של IC 50 ערכים () fluconazole ו (ב) amphotericin B באמצעות Ca BChip. תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של amphotericin B שטופלו biofilms מוצגים (C). התוצאות הן ממוצע ± שגיאת התקן אומר שני שבבים נפרדים המכילים 10 משכפל עבור כל תנאי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פיתחנו מבוססי תאים בצפיפות גבוהה microarray, Ca BChip, בהיקף של כרכים nanoliter של biofilms קנדידה אלביקנס. Microarray הודפס על זכוכית שונה מצעים, אשר אפשרו התקשרות איתנה של כתמים ג'ל קולגן, תוך מתן hydrophobicity הכרחי ג'ל, שאינו מתפשט 3D חצי כדור. אחת Ca BChip יכול להחליף כ 8 צלחות 96 טוב, וצ'יפס כמה ניתן להדפיס ומעובד באותו זמן. השבב עושה שימוש בקנה מידה ננו תרבויות, מאפשרת טיפול קל ומהיר, הוא מקובל אוטומציה, מצמצם את עלויות עבודת כפיים והוא תואם באופן מלא עם הטכנולוגיה microarray ציוד סטנדרטי. יתר על כן, הטכנולוגיה היא גמישה וניתן להתאים בקלות מיקרואורגניזמים אחרים. למרות המזעור, את ננו biofilms נוצר על נכסים ע"א BChip התצוגה האופייניים ג אלביקנס אורח חיים biofilm, כולל 3D architecturE ו עמידות לתרופה. לכן, BChip Ca מאפשר הקרנת תפוקה גבוהה נכון, ויש לו פוטנציאל לשינוי פרדיגמה גילוי תרופות מיקרוביאלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
חוסה לופז ל-ריבו ואת אנאנד ק ההון Ramasubramanian משלו MicrobeHTS Technologies, Inc, המפתחת תרופות נגד פטריות. MicrobeHTS Technologies, Inc סיפקה כל תמיכה כספית למחקרים אלו.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה בחלקה על ידי תרומות של דרום טקסס טכנולוגיה ניהול (POCrr 2009.041), מכון שילוב של רפואה ומדע מהמרכז הלאומי למחקר משאבים (UL 1RR025767), ומן המכון הלאומי למחקר דנטלי & Craniofacial ( 5R21DE017294).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 | |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 | |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A | |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A | |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD | |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 | |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 | |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC | |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | ||
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
References
- Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
- Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
- Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
- Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
- Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).
