Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)
Summary
Biz 3D nano-biyofilm oluşan yüksek yoğunluklu mikroarray platformu geliştirdi<em> C. albicans</em> Denir<em> Ca</em> BChip. Ilaç duyarlılık profili bir test<em> Ca</em> BChip mantar çip ideal antifungal ilaçların gerçek yüksek verimli görüntüleme için uygundur düşündüren, geleneksel 96-plaka modeli ile karşılaştırılabilir.
Abstract
Candida albicans şu anda ABD hastanelerinde 1 dördüncü en sık görülen nozokomiyal kan dolaşımı enfeksiyonu temsil kandidiazis ana etyolojik ajan kalır. Bu fırsatçı enfeksiyonlar tehlikeye bireylerin sayısının artmasıyla için büyüyen bir tehdit ve kabul edilemez yüksek mortalite oranları taşırlar. Bu en sık kullanılan antifungal ajanlara karşı direncin ortaya çıkmasına da antifungal ilaçların sınırlı cephaneliği nedeniyle kısmen, ama. Ileri tedavi komplike kandidiyazis tezahürleri çoğunluğu biyofilmlerin oluşumu ile ilişkili olduğu bir gerçektir ve bu biyofilm içindeki hücrelerin klinik olarak en kullanılan antifungal ajanlar 2 direnç seviyelerinin artmasına göstermektedir. Burada C. oluşan bir yüksek yoğunluklu mikroarray geliştirilmesi tarif Biz Ca BChip 3 adında var albicans nano-biyofilmlerin. Kısaca, bir robot microarrayer t kullanılırC. o baskı maya hücreleri sağlam bir zemin üzerine albicans. Baskı sırasında, maya hücreleri gibi nL 50 kadar düşük ve uygun bir kaplama ile birlikte bir cam zemin üzerinde immobilize bir birimi kullanılarak, üç boyutlu bir matris içine alınır. İlk baskıdan sonra, slaytlar biyofilm geliştirilmesi için izin vermek için 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Bu dönemde noktalar olgun C ile ilişkili tipik yapısal ve fenotipik özellikleri göstermeyen tam gelişmiş "nano-biyofilm" içine büyümek albicans biyofilm (yani morfolojik karmaşıklığı, üç boyutlu mimari ve ilaç direnci) 4. Genel olarak, Ca BChip ~ 750 eşdeğeri ve mekansal farklı biyofilm oluşur; birden fazla fiş baskılı ve aynı anda işlenebilir olduğu ek avantaj. Hücre canlılığı FUN1 metabolik floresan yoğunluğu mikroarray tarayıcı kullanarak lekeyi ölçerek tahmin edilmektedir. Bu mantar çip ideal u için uygundurantifungal ilaç keşfi için gerçek yüksek verimlilik tarama se. Mevcut standartlar (yani biyofilm 5 96-mikrotiter plate modeli) ile karşılaştırıldığında, fungal biyofilm çip ana avantajları otomasyon, minyatür, miktarı ve reaktifler ve analizler zaman maliyet tasarrufu, hem de işçiliğinin ortadan kaldırılmasına olan yoğun adımları. Biz çip önemli antifungal ilaç keşfi sürecini hızlandırmak inanıyorum.
Protocol
Discussion
Biz Candida albicans biyofilmlerin nanoliter ciltten oluşan hücre tabanlı yüksek yoğunluklu mikroarray, Ca BChip geliştirdik. Mikroarray olmayan yayılan, hemisferik 3D jel için gerekli hidrofobluğu sağlarken kollajen jel lekelerin sağlam eki için izin modifiye cam malzeme üzerine basılmıştır. A tek bir Ca BChip yaklaşık sekiz 96-kuyucuklu plaklar yerini alabilir ve birkaç yongaları aynı anda basılır ve işlenebilir. Çip, nano ölçekli kültürler kullanır kolay ve h?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Güney Teksas Teknoloji Yönetimi (POCrr 2009,041), Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi (UL 1RR025767) ile Tıp ve Bilim Entegrasyon Enstitüsü, gelen hibelerle ve Diş & Kraniyofasiyal Araştırmalar Ulusal Enstitüsü (kısmen finanse edildi 5R21DE017294).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | |
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
References
- Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
- Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
- Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
- Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
- Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).
