Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) für das Hochdurchsatz-Screening-Antimykotikum
Summary
Wir haben eine hohe Dichte Microarray-Plattform bestehend aus 3D-Nano-Biofilme von entwickelten<em> C albicans</em> Genannt<em> Ca</em> BChip. Die Anfälligkeit Profil von Medikamenten auf ein getestet<em> Ca</em> BChip ist vergleichbar mit dem konventionellen 96-Well-Platte-Modell, was darauf hindeutet, dass der Pilz-Chip ist ideal für echtes High-Throughput-Screening von Antimykotika geeignet.
Abstract
Candida albicans vor der wichtigste Erreger der Candidiasis, die derzeit die vierthäufigste nosokomiale Infektion der Blutbahn in US-Krankenhäusern ein. Diese opportunistische Infektionen stellen eine wachsende Bedrohung für eine wachsende Zahl von kompromittierten Individuen und tragen inakzeptabel hohen Sterblichkeitsraten. Dies ist zum Teil aufgrund der begrenzten Arsenal von Antimykotika, sondern auch auf die Entstehung von Resistenzen gegen die am häufigsten verwendeten Antimykotika. Eine weitere Komplikation der Behandlung ist die Tatsache, dass eine Mehrheit der Manifestationen der Candidiasis mit der Bildung von Biofilmen assoziiert sind, und Zellen innerhalb dieser Biofilme zeigen erhöhte Beständigkeit gegen die meisten klinisch-Antimykotika 2 verwendet. Hier beschreiben wir die Entwicklung eines High-Density-Microarray, die aus C besteht albicans Nano-Biofilme, die wir Ca BChip 3 benannt haben. Kurz gesagt, wird ein Roboter-Microarrayer t verwendeto Druck Hefezellen C albicans auf ein festes Substrat. Während des Druckens werden die Hefezellen in einer dreidimensionalen Matrix mit einem Volumen von nur 50 nl und immobilisiert auf einem Glassubstrat mit einer geeigneten Beschichtung eingeschlossen. Nach anfänglichen Druck werden die Folien bei 37 ° C für 24 Stunden inkubiert, um für Biofilmentwicklung ermöglichen. Während dieser Zeit wachsen die Flecken in voll entwickelte "Nano-Biofilme", das zeigen die typischen Struktur-und phänotypische Merkmale mit altem C verbunden albicans Biofilmen (dh morphologische Komplexität, dreidimensionale Architektur und drug resistance) 4. Insgesamt ist das Ca BChip von ~ 750 entspricht und räumlich unterschiedlichen Biofilme bestehen; mit dem zusätzlichen Vorteil, dass mehrere Chips gedruckt und verarbeitet werden können simultan. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch Messen der Fluoreszenzintensität der FUN1 metabolischen Färbung unter Verwendung eines Mikroarray-Abtastvorrichtung geschätzt. Dieser Pilz-Chip eignet sich ideal für u geeignetse in echter High-Throughput-Screening für antimykotische Wirkstoffforschung. Im Vergleich zu aktuellen Standards (dh der 96-well Mikrotiterplatten-Modell der Biofilmbildung 5), sind die wichtigsten Vorteile des Pilz-Biofilm-Chip-Automatisierung, Miniaturisierung, Einsparungen bei den Mengen und Kosten der Reagenzien und Analysen Zeit, sowie die Beseitigung von Arbeitskräften intensive Schritte. Wir glauben, dass solche Chips wird erheblich beschleunigen den antimykotischen Wirkstoff-Forschung.
Protocol
Discussion
Wir haben eine zell-basierte High-Density-Microarrays, Ca BChip, bestehend aus Nanoliterbereich Candida albicans Biofilmen entwickelt. Der Mikroarray wurde auf modifizierten Glas-Substrate, die für robuste Befestigung Kollagengel Stellen erlaubt und gleichzeitig Hydrophobie, die für eine nicht anzulegen, halbkugelförmigen 3D-Gel gedruckt. Eine einzelne Ca BChip ersetzen etwa acht 96-Well-Platten und mehrere Chips können ausgedruckt und zur gleichen Zeit verarbeitet werden. Der Chip nutzt N…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem Süden von Texas Technologiemanagement (POCrr 2009,041), das Institut für die Integration von Medizin und Wissenschaft vom National Center for Research Resources (UL 1RR025767), und vom National Institute of Dental & Kraniofaziale Forschung (gefördert 5R21DE017294).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | |
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
References
- Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
- Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
- Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
- Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
- Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).
