Summary

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) für das Hochdurchsatz-Screening-Antimykotikum

Published: July 18, 2012
doi:

Summary

Wir haben eine hohe Dichte Microarray-Plattform bestehend aus 3D-Nano-Biofilme von entwickelten<em> C albicans</em> Genannt<em> Ca</em> BChip. Die Anfälligkeit Profil von Medikamenten auf ein getestet<em> Ca</em> BChip ist vergleichbar mit dem konventionellen 96-Well-Platte-Modell, was darauf hindeutet, dass der Pilz-Chip ist ideal für echtes High-Throughput-Screening von Antimykotika geeignet.

Abstract

Candida albicans vor der wichtigste Erreger der Candidiasis, die derzeit die vierthäufigste nosokomiale Infektion der Blutbahn in US-Krankenhäusern ein. Diese opportunistische Infektionen stellen eine wachsende Bedrohung für eine wachsende Zahl von kompromittierten Individuen und tragen inakzeptabel hohen Sterblichkeitsraten. Dies ist zum Teil aufgrund der begrenzten Arsenal von Antimykotika, sondern auch auf die Entstehung von Resistenzen gegen die am häufigsten verwendeten Antimykotika. Eine weitere Komplikation der Behandlung ist die Tatsache, dass eine Mehrheit der Manifestationen der Candidiasis mit der Bildung von Biofilmen assoziiert sind, und Zellen innerhalb dieser Biofilme zeigen erhöhte Beständigkeit gegen die meisten klinisch-Antimykotika 2 verwendet. Hier beschreiben wir die Entwicklung eines High-Density-Microarray, die aus C besteht albicans Nano-Biofilme, die wir Ca BChip 3 benannt haben. Kurz gesagt, wird ein Roboter-Microarrayer t verwendeto Druck Hefezellen C albicans auf ein festes Substrat. Während des Druckens werden die Hefezellen in einer dreidimensionalen Matrix mit einem Volumen von nur 50 nl und immobilisiert auf einem Glassubstrat mit einer geeigneten Beschichtung eingeschlossen. Nach anfänglichen Druck werden die Folien bei 37 ° C für 24 Stunden inkubiert, um für Biofilmentwicklung ermöglichen. Während dieser Zeit wachsen die Flecken in voll entwickelte "Nano-Biofilme", ​​das zeigen die typischen Struktur-und phänotypische Merkmale mit altem C verbunden albicans Biofilmen (dh morphologische Komplexität, dreidimensionale Architektur und drug resistance) 4. Insgesamt ist das Ca BChip von ~ 750 entspricht und räumlich unterschiedlichen Biofilme bestehen; mit dem zusätzlichen Vorteil, dass mehrere Chips gedruckt und verarbeitet werden können simultan. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch Messen der Fluoreszenzintensität der FUN1 metabolischen Färbung unter Verwendung eines Mikroarray-Abtastvorrichtung geschätzt. Dieser Pilz-Chip eignet sich ideal für u geeignetse in echter High-Throughput-Screening für antimykotische Wirkstoffforschung. Im Vergleich zu aktuellen Standards (dh der 96-well Mikrotiterplatten-Modell der Biofilmbildung 5), sind die wichtigsten Vorteile des Pilz-Biofilm-Chip-Automatisierung, Miniaturisierung, Einsparungen bei den Mengen und Kosten der Reagenzien und Analysen Zeit, sowie die Beseitigung von Arbeitskräften intensive Schritte. Wir glauben, dass solche Chips wird erheblich beschleunigen den antimykotischen Wirkstoff-Forschung.

Protocol

1. Synthese von funktionalisierten Folien Legen Sie die Objektträger in einem herausnehmbaren Objektträgergestell, und waschen zweimal durch Eintauchen in eine Küvette mit 99% Ethanol (Grading). Wischen Sie die Folien mit Papiertüchern reinigen (Sicherstellung nicht um Papierstaub zu generieren), trocken und mit einem Strahl aus unter Druck stehendem Stickstoffgas. HINWEIS: Verwenden Sie nicht Kim-Wipes, um die Folien wischen, wie es Feinpapier Staub erzeugen wü…

Discussion

Wir haben eine zell-basierte High-Density-Microarrays, Ca BChip, bestehend aus Nanoliterbereich Candida albicans Biofilmen entwickelt. Der Mikroarray wurde auf modifizierten Glas-Substrate, die für robuste Befestigung Kollagengel Stellen erlaubt und gleichzeitig Hydrophobie, die für eine nicht anzulegen, halbkugelförmigen 3D-Gel gedruckt. Eine einzelne Ca BChip ersetzen etwa acht 96-Well-Platten und mehrere Chips können ausgedruckt und zur gleichen Zeit verarbeitet werden. Der Chip nutzt N…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem Süden von Texas Technologiemanagement (POCrr 2009,041), das Institut für die Integration von Medizin und Wissenschaft vom National Center for Research Resources (UL 1RR025767), und vom National Institute of Dental & Kraniofaziale Forschung (gefördert 5R21DE017294).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich 440140
Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) Sigma-Aldrich 426946
Glass microscopy slides Fisher Scientific 12-549-3
Rat Tail collagen type I BD Biosciences 354236
Robotic Microarrayer Omnigrid Micro MICROSYS4000/4100A
Microarray Scanner Genepix Personal 4100A GENEPIX4100A
Hybridization Cassette ArrayIt Corporation AHCXD
FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo​-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenyl​quinoliniumiodide] Invitrogen Corp. F-7030
Fluconazole Sicor Pharmaceuticals, Inc. J02AC01
Amphotericin B Sigma A2411
RPMI-1640 Mediatech, Inc. 50-020-PC
Ceramic Tip 190 μm orifice Digilab 60020441-00
GraphPad Prism Software GraphPad Software, Inc.  
Genepix Pro V4.1 Molecular Devices  

References

  1. Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
  2. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
  3. Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
  4. Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  5. Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
  6. Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
  7. Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
  8. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  9. Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  10. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
  11. Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).

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Cite This Article
Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening. J. Vis. Exp. (65), e3845, doi:10.3791/3845 (2012).

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