Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) for High-throughput antifungal Drug Screening
Summary
Vi har utviklet en høy tetthet microarray plattform bestående av 3D nano-biofilm av<em> C. albicans</em> Kalt<em> Ca</em> BChip. Mottakelighet profilen narkotika testet på en<em> Ca</em> BChip er sammenlignbar med den konvensjonelle 96-brønnen plate modell, noe som tyder på at sopp brikken er ideell for ekte high-throughput screening av soppdrepende medisiner.
Abstract
Candida albicans fortsatt den viktigste agens av candidiasis, som for tiden representerer den fjerde vanligste nosokomiale blodbanen infeksjon i amerikanske sykehus 1. Disse opportunistiske infeksjoner utgjør en økende trussel for et økende antall av kompromitterte individer, og bære uakseptabelt høy dødelighet. Dette er delvis på grunn av den begrensede arsenal av soppdrepende medisiner, men også til utvikling av resistens mot de mest brukte soppdrepende midler. Videre kompliserer behandlingen er det faktum at et flertall av manifestasjoner av candidiasis er forbundet med dannelse av biofilm, og celler innenfor disse biofilmer viser økte nivåer av motstand til mest klinisk brukte antimykotika 2. Her beskriver vi utviklingen av en høy tetthet microarray som består av C. albicans nano-biofilm, som vi har kalt Ca BChip tre. Kort fortalt er en robot microarrayer brukt to print gjærceller av C. albicans inn på et fast underlag. Under utskrift er de gjærceller innelukket i en tredimensjonal matrise med et volum så lavt som 50 NL og immobilisert på et glass substrat med en passende belegg. Etter innledende utskriften er de lysbildene inkuberes ved 37 ° C i 24 timer for å tillate biofilm utvikling. I denne perioden flekkene vokse til fullt utviklede "nano-biofilmer" viser at typiske strukturelle og fenotypiske egenskaper knyttet moden C. albicans biofilm (dvs. morfologisk kompleksitet, tredimensjonale arkitektur og legemiddelresistens) 4. Totalt sett er Ca BChip sammensatt på ~ 750 likeverdige og romlig tydelig biofilm, med den ekstra fordelen at flere sjetonger kan skrives ut og behandles samtidig. Celleviabilitet anslås ved å måle fluorescerende intensiteten FUN1 metabolsk flekken med en microarray scanner. Dette sopp chip er ideelt for use i ekte high-throughput screening for soppdrepende medisiner. Sammenlignet med gjeldende standarder (dvs. 96-brønnen microtiter plate modell av biofilmdannelse 5), de viktigste fordelene av sopp biofilm chip er automatisering, miniatyrisering, besparelser i mengde og kostnad av reagenser og analyser tid, samt eliminering av arbeidskraft intensive trinn. Vi mener at en slik chip vil gi en betydelig raskere soppdrepende medisiner prosess.
Protocol
Discussion
Vi har utviklet en cellebasert høy tetthet microarray, Ca BChip, bestående av nanoliter volumer av Candida albicans biofilm. Den microarray ble trykt på endret glass underlag, som tillot robust feste kollagen gel flekker samtidig som det gir hydrofobisitet nødvendig for en ikke-spredning, halvkuleformet 3D gel. En enkelt Ca BChip kan erstatte ca åtte 96-brønns plater, og flere chips kan skrives ut og behandles på samme tid. Brikken benytter nano-skala kulturer, sørger for enkel og rask…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert delvis med tilskudd fra South Texas Technology Management (POCrr 2009.041), Institutt for integrering av medisin og vitenskap fra National Center for Research Resources (UL 1RR025767), og fra National Institute of Dental og kraniofaciale Research ( 5R21DE017294).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140 |
| Polystyrene-Co-Maleic Anhydride (PS-MA) | Sigma-Aldrich | 426946 |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-549-3 |
| Rat Tail collagen type I | BD Biosciences | 354236 |
| Robotic Microarrayer | Omnigrid Micro | MICROSYS4000/4100A |
| Microarray Scanner | Genepix Personal 4100A | GENEPIX4100A |
| Hybridization Cassette | ArrayIt Corporation | AHCXD |
| FUN1 [2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol-2-yl)-methylidene)-1-phenylquinoliniumiodide] | Invitrogen Corp. | F-7030 |
| Fluconazole | Sicor Pharmaceuticals, Inc. | J02AC01 |
| Amphotericin B | Sigma | A2411 |
| RPMI-1640 | Mediatech, Inc. | 50-020-PC |
| Ceramic Tip 190 μm orifice | Digilab | 60020441-00 |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc. | |
| Genepix Pro V4.1 | Molecular Devices |
References
- Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
- Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
- Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
- Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
- Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).
