Summary
Deze methode beschrijft de combinatorische synthese van biologisch afbreekbare polyanhydride film en nanodeeltjes bibliotheken en het high-throughput detectie van proteïneafgifte uit deze bibliotheken.
Abstract
Polyanhydriden zijn een klasse van biomaterialen met uitstekende biocompatibiliteit en drug delivery mogelijkheden. Terwijl ze uitvoerig bestudeerd met gebruikelijke een-sample-at-a-time synthesetechnieken, een recent high-throughput aanpak ontwikkeld waardoor de synthese en het testen van grote bibliotheken van polyanhydriden 1. Dit bevordert een efficiënte optimalisatie-en ontwerpproces van deze biomaterialen voor drugs-en toediening van vaccins toepassingen. De werkwijze in dit werk beschrijft de combinatorische synthese van biologisch afbreekbare polyanhydride film en nanodeeltjes bibliotheken en high-throughput detectie van proteïneafgifte uit deze bibliotheken. Bij deze robot bediende methode (figuur 1), zijn lineaire actuatoren en spuitpompen gecontroleerd door LabVIEW, die een hands-free geautomatiseerd protocol maakt, waardoor fout van de gebruiker. Bovendien deze werkwijze maakt de snelle fabricage van micro-schaal polymeer libraries, redvóór het eerste batchgrootte terwijl resulteert in de creatie van Multivariant polymeersystemen. Deze combinatorische benadering van polymeersynthese vergemakkelijkt de synthese van maximaal 15 verschillende polymeren in een equivalente hoeveelheid tijd die het zou kosten om een polymeer conventioneel synthetiseren. Bovendien kan de combinatorische polymeerbibliotheek worden vervaardigd in lege of proteïne geladen geometrieën zoals films of nanodeeltjes bij oplossen van het polymeer in een oplosmiddel bibliotheek en precipitatie in een niet-oplosmiddel (nanodeeltjes) of door vacuümdroging (voor films). Bij het laden van een fluorochroom-geconjugeerde eiwit in het polymeer bibliotheken kunnen eiwit afgiftekinetiek worden beoordeeld op high-throughput met fluorescentie gebaseerde detectiemethode (figuren 2 en 3) zoals eerder beschreven een. Deze combinatorische platform is gevalideerd met conventionele methoden 2 en de polyanhydride film en nanodeeltjes bibliotheken zijn gekarakteriseerd met
Protocol
1. Combinatorische Polymer Bibliotheek Synthese (Variërend in Polymer Chemistry) - zie figuur 1 voor Robotic Setup
- Los elk monomeer in het geschikte oplosmiddel (concentratie = 25 mg / ml) en te laden in een 10cc gasdichte injectiespuit.
- Bevestig de oplosmiddelbestendige lokmiddel lock capillaire buizen aan het eind van elke spuit.
- Plaats de spuiten op de spuit pompen (New Era Programmeerbare spuitpompen) en vergrendelen.
- Stel de lineaire aandrijving (Zaber) naar de uitgangspositie.
- Met behulp van ring statiefklemmen, plaats het einde van beide capillaire buizen in de uitgangspositie flacon / goed voor monomeer depositie.
- Start de LabVIEW programma, dat pompen met variabele hoeveelheden van elk monomeer in ieder putje afhankelijk van de gewenste copolymeersamenstelling. Dit wordt bereikt door het programma instrueren de Z-as actuator om de capillaire buisjes omlaag in de flacon / putje en vervolgens elke pomp om het gewenste volume te doseren. Next het programma opdracht aan de Z-actuator terug naar de uitgangspositie en de X-en Y-actuators om naar de positie van het volgende injectieflacon / well. Dit wordt uitgevoerd tot elk putje werd de gewenste hoeveelheid monomeer afgezet in.
- Na monomeer depositie wordt de multi-well of meerdere flesje monomeer bibliotheek naar een voorverwarmde oven en gedurende vacuum onder vacuüm voor de duur van de condensatiepolymerisatiereactie. Voor CPH: SA synthese wordt de reactie uitgevoerd bij 180 ° C, 0,3 torr, gedurende 1,5 uur, maar deze reactieomstandigheden varieert tussen verschillende polymeersystemen.
2. Combinatoriële Blank en eiwit-loaded polymeer nanodeeltje en Film Bibliotheek Fabrication - zie figuur 1 voor Robotic Setup
- De injectiespuit in de eerste programmeerbare spuitpomp is gevuld met een oplosmiddel (lege bibliotheek) of een oplosmiddel met eiwit gedispergeerd zijn (eiwit-loaded library) terwijl de spuit in de tweede spuitpomp leeg gelaten. Buizen voor nanodeeltjes fabricage in de aangrenzende monsterhouder zijn gevuld met het niet-oplosmiddel (verhouding van oplosmiddel tot niet-oplosmiddel is 1 tot 100). Voor filmvervaardiging een lege multi-well plaat gebruikt in plaats van de buizen in de aangrenzende monsterhouder.
- Met het LabVIEW programma wordt het oplosmiddel neergeslagen in alle flesjes polymeer / putjes van de bibliotheek (concentratie = 20 mg / ml) en gedurende 1-5 min.. Een optionele stap sonicatie (30 s bij 40 Hz) kan worden ingevoerd om volledig oplossen van polymeer te waarborgen.
- Vervolgens door het opzetten van een aparte LabVIEW programma wordt het monster dat in de lege spuit, en gedeponeerd in de bijbehorende buis van non-solvent (nanodeeltjes) of lege put (films) in de aangrenzende monsterhouder.
- Dit proces wordt uitgevoerd voor elke samenstelling van de discrete polymeerbibliotheek.
- De nanodeeltjes of film bibliotheek wordt vervolgens in een vacuümkamer voor oplosmiddel en niet-oplosmiddel verwijderd (de nanodeeltjes library kan worden hersteld met vacuümfiltratie).
3. High-throughput Protein afgiftekinetiek
- Voor het onderzoeken van high-throughput eiwit afgiftekinetiek van een polymeerbibliotheek, een 96 deep-sprongen (2 ml / putje) wordt polypropyleen plaat gewijzigd dat het bovenste 1/3 van de wand en in aangrenzende kolommen (ex: A en B, C en D, E en F, G en H) wordt verwijderd aan de putjes aansluiten. Het eiwit beladen films worden vervaardigd in of nanodeeltjes overgebracht naar deze plaat bij hoge doorvoer afgiftekinetiek studies uitgevoerd. Eiwit-loaded nanodeeltjes of film monsters mag alleen worden geplaatst in een goed van de aangrenzende kolommen (ex: A, C, E en G). Zie afbeelding 4 voor meer informatie.
- Na de overdracht van de nanodeeltjes aan de 96 diep welden versie plaat, worden de deeltjes bezinken. PBS buffer (0,1 mM, pH 7,4) wordt langzaam toegevoegd aan elk monster putje (kolommen A, C, E en G) en vervolgens elke naburige put (kolommen B, D, F en H) totdat de putjes gevuld zijn en de buffer vrij stromend tussen aangrenzende wells. Voor nanodeeltjes Dit proces dient te worden uitgevoerd met extra voorzichtigheid te zorgen voor de deeltjes achterblijven op de bodem van de monsterholte (kolommen A, C, E en G) en niet overgebracht naar de aangrenzende afgifte well (kolommen B, D, F en H). In sommige gevallen wordt centrifugeren moet lokaliseren de nanodeeltjes monsters onderaan de monsteropening (kolommen A, C, E en G).
- Vervolgens wordt de lossende plaat afgesloten met een deksel en op de gewenste temperatuur (bijvoorbeeld 37 ° C) onder roeren de duur van het experiment.
- Bij incrementele tijdstippen (bijv. 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24 en 30 dagen) de hoeveelheid vrijkomende fluorochroom-geconjugeerde eiwit wordt gekwantificeerd met een Typhoon 9400 Flatbed Fluorescent Scanner ( GE Healthcare). De lossende plaat wordt op de scanner oppervlak gescand met de juiste excitatie en emissie laser filters, en de fluorescentiesterkte van het model eiwit in de afgifte putjes (kolommen B, D, F en H) wordt gekwantificeerd (Image Quant). Voorgesteld wordt eiwitstandaarden van bekende concentraties worden opgenomen in de wells plaat berekening proteïne hoeveelheid en waarop fluorochroom quenching.
4. Representatieve resultaten
Bij vervaardiging van het polymeer library werd karakterisering uitgevoerd met 1H NMR, GPC en FTIR deze combinatoriële methode te valideren 1,7,8,11. Molecuulgewichten variëren van 10.000-20.000 g / mol, polydispersiteitsindex varieert van 1.5-3.0, en chemische samenstelling is aangetoond nauwkeurig en in overeenstemming met gebruikelijke werkwijzen van synthese polyanhydride 12-15. Ook SEM beelden van de nanodeeltjes bibliotheken vertoonden dezelfde oppervlakte morfologie, grootte en grootteverdeling als die van conventioneel gefabriceerde nanodeeltjes 2. Proteïne afgifte kinetics polyanhydride van nanodeeltjes of films wordt uitgevoerd in een gemodificeerde putjes zoals hiervoor is beschreven 1. De resultaten toonden een ongeveer nulde orde afgifte met of zonder burst afhankelijk eiwitbelading en polymeerchemie (figuren 2 en 3) 1,12,14,16.
Figuur 1. Combinatorial polymeerfilm en nanodeeltjes vervaardigingapparaat.
Figuur 2 High-throughput afgifte van Texas Red runderserumalbumine (TRBSA) van een CPH:. SA polymeer nanodeeltje bibliotheek. SA-rijke polymeer chemie los ingekapseld TRBSA het snelst, terwijl CPH-rijke polymeer chemie laat de langzaamste. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatietie en n = 4. Herdrukt met toestemming van Petersen et. al.. 1. Copyright 2010 American Chemical Society.
Figuur 3 High-throughput afgifte van Texas Red runderserumalbumine (TRBSA) van een CPTEG:. CPH polymeerfilm bibliotheek. CPTEG-rijke polymeer chemie los ingekapseld TRBSA het snelst, terwijl CPH-rijke polymeer chemie laat de langzaamste. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie en n = 3.
Figuur 4. Afbeelding van de twee naburige putten "voor" en "na" wijziging in de 96 diepe welden polypropyleen plaat. De "na" wijziging beeld rechts toont ook de toevoeging van een polymeerfilm (onderaan links well) met een ingekapselde fluorescent moleculevrijkomt tussen de twee putten in een bufferoplossing. Het model fluorescent molecule wordt dan gedetecteerd in het denkbeeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kennis van de noodzakelijke synthesecondities en glasovergangstemperaturen (Tg) van de polymeren worden gesynthetiseerd zijn essentieel voor library fabricage. Als de Tg's zijn onder kamertemperatuur, kan de nanodeeltjes fabricage stap moet worden uitgevoerd in een gecontroleerde omgeving temperatuur onder de Tg van de polymeren. Bovendien moet voorzichtigheid worden gezorgd dat alle apparatuur die in contact komt met hoge temperaturen en de oplosmiddelen moeten geschikt om deze te hanteren. Verscheidene parameters van dit protocol kan worden aangepast (bijvoorbeeld temperatuur, vacuüm, incubatietijden, oplosmiddelen, niet-oplosmiddelen, polymeerconcentratie, oplosmiddel non-solvent verhoudingen, enz.) verschillende polymeersystemen geschikt voor synthese of deeltjes / film fabricage. In sommige gevallen nanodeeltjes niet stabiel in oplosmiddelen voor langere perioden (voldoende voor oplosmiddelverwijdering door vacuümdroging) zodat twee verschillende oplosmiddelen removaal methoden kunnen worden gebruikt. 1) De deeltjes kunnen langzaam worden gecentrifugeerd, het supernatant oplosmiddel gedecanteerd en de overgebleven deeltjes gedroogd of 2) de deeltjes worden gescheiden door vacuümfiltratie en gedroogd. Na vervaardiging van blanco of proteïne geladen nanodeeltjes / films, high-throughput karakterisering en testen kunnen worden uitgevoerd om de biomaterialen voor eiwit, cellulaire of gastheer interacties te screenen. Deze high-throughput methode maakt de snelle optimalisatie van biomateriaal prestaties voor de gewenste toepassing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de ONR-MURI Award (NN00014-06-1-1176) en de US Army Medical Research en Materieel Command (Grant No W81XWH-10-1-0806) voor financiële steun. Dit materiaal is gebaseerd op het werk ondersteund door de National Science Foundation onder Grant No EEG 0552584 en 0851519.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| Glass cuvettes | Scientific Strategies | G102 | |
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| U96 DeepWell Plates 1.3 ml & 2.0 ml | Thermo Scientific: Nunc | 278743 | |
| Well cap mats | Thermo Scientific: Nunc | 276000 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-79 | |
| Whatman Grade 50 Circles 90 mm | Whatman | 1450-090 |
References
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres. J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers. J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).
- Petersen, L. K. High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles. Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).
- Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges. Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).
- Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation. Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior. J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).
- Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods. ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).
- Adler, A. F. High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries. Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).
- Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres. J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).
- Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations. Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Carrillo-Conde, B. Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens. Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).
