Summary

Síntese combinatória de alta capacidade e liberação de proteínas a partir de polímero de Cinema e Bibliotecas Nanopartículas

Published: September 06, 2012
doi:

Summary

O método descreve a síntese combinatória de película de polianidrido biodegradáveis ​​e bibliotecas de nanopartículas e de detecção de elevado débito de libertação de proteínas a partir destas bibliotecas.

Abstract

Polianidridos são uma classe de biomateriais com excelente biocompatibilidade e capacidade de entrega de drogas. Embora tenham sido estudados extensivamente com convencional de um exemplo de-a-um-tempo técnicas de síntese, uma abordagem mais recente de alto rendimento tem sido desenvolvido permitindo a síntese e teste de grandes bibliotecas de polianidridos 1. Isto irá facilitar a optimização mais eficiente e processo de concepção desses biomateriais para aplicações de entrega de drogas e vacinas. O método, neste trabalho descreve a síntese combinatória de película de polianidrido biodegradáveis ​​e bibliotecas de nanopartículas e de detecção de elevado débito de libertação de proteínas a partir destas bibliotecas. Neste método roboticamente operado (Figura 1), os actuadores lineares e bombas de seringa são controlados por LabVIEW, que permite que um protocolo de mãos-livres automatizado, eliminando o erro do utilizador. Além disso, este método permite a fabricação rápida de bibliotecas de micro-escala de polímero, vermelhoucing o tamanho do lote, enquanto que resulta na criação de sistemas de multivariante polímero. Esta abordagem combinatória para a síntese do polímero facilita a síntese de até 15 diferentes polímeros em uma quantidade equivalente de tempo que seria necessário para sintetizar um polímero convencional. Além disso, a biblioteca combinatória de polímero pode ser fabricada em geometrias em branco ou proteína-carregado incluindo filmes ou nanopartículas mediante dissolução da biblioteca de polímero em um solvente e precipitação num não-solvente (por nanopartículas), ou por secagem sob vácuo (para filmes). Durante o carregamento de uma proteína conjugados com fluorocromos para as bibliotecas de polímeros, a cinética de libertação de proteína podem ser avaliadas em alto rendimento, utilizando um método de detecção de fluorescência de base (Figuras 2 e 3), conforme descrito anteriormente 1. Esta plataforma combinatória foi validado com métodos convencionais de 2 e a película de polianidrido e bibliotecas de nanopartículas foram caracterizadas com <sup> 1 H NMR e FTIR. As bibliotecas foram pesquisadas quanto a cinética de libertação da proteína, estabilidade e antigenicidade; in vitro de toxicidade celular, citocinas, produção superfície marcador de expressão, adesão, proliferação e diferenciação, e na biodistribuição in vivo e mucoadesão 1-11. O método desenvolvido aqui combinatória permite alto rendimento de síntese de polímeros e fabrico de proteína-carregado de nanopartículas e bibliotecas de película, a qual pode, por sua vez, ser rastreadas in vitro e in vivo para a optimização do desempenho do biomaterial.

Protocol

1. Combinatória de Polímeros Síntese Library (Variando em Polymer Química) – veja a Figura 1 para a configuração Robotic Dissolver cada monómero na apropriada (concentração = 25 mg / ml) com solvente e carregar cada para uma seringa de 10 cc de gás apertado. Anexar os solventes tubos capilares de bloqueio lure resistentes ao final de cada seringa. Coloque as seringas nas bombas de seringa (New Era bombas de seringa Programáveis) e bloquear a posição. …

Discussion

O conhecimento das condições de síntese necessários e as temperaturas de transição vítrea (T g s) dos polímeros a ser sintetizados são essenciais para o fabrico de biblioteca. Se o T g s estão abaixo da temperatura ambiente, o passo de fabrico de nanopartículas podem ter de ser realizado num ambiente com temperatura controlada abaixo da Tg dos polímeros. Além disso, o cuidado deve ser tomado para assegurar que todo o equipamento que entra em contato com altas temperaturas e …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem o Prêmio ONR MURI-(NN00014-06-1-1176) e os EUA Army Medical Research e de Material Command (Grant No. W81XWH-10-1-0806) de apoio financeiro. Este material é baseado num trabalho apoiado pela National Science Foundation, Grant CEE n º 0552584 e 0851519.

Materials

Name Company Catalog number
Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis Zaber Technologies T-XYZ-LSM050A-KT04
NE-1000 Single Syringe Pump New Era Pump Systems NE-1000
Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes Corning 07-250-125
Glass cuvettes Scientific Strategies G102
LabVIEW National Instruments 776671-35
SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc Sigma Aldrich 509507
U96 DeepWell Plates 1.3 ml & 2.0 ml Thermo Scientific: Nunc 278743
Well cap mats Thermo Scientific: Nunc 276000
Typhoon 9400 GE Healthcare 63-0055-79
Whatman Grade 50 Circles 90 mm Whatman 1450-090

References

  1. Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres. J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).
  2. Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
  3. Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers. J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).
  4. Petersen, L. K. High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles. Adv. Healthcare Mater. , (2012).
  5. Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges. Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).
  6. Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation. Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).
  7. Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
  8. Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
  9. Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior. J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).
  10. Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods. ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).
  11. Adler, A. F. High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries. Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).
  12. Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres. J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).
  13. Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations. Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).
  14. Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
  15. Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
  16. Carrillo-Conde, B. Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens. Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).

Play Video

Cite This Article
Petersen, L. K., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B. Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries. J. Vis. Exp. (67), e3882, doi:10.3791/3882 (2012).

View Video